304 з нержавеючай сталі, зварная спіральная труба / трубка, хімічны кампанент, біясінтэтычны патэнцыял глабальнага марскога мікрабіёма

Дзякуй за наведванне Nature.com.Вы выкарыстоўваеце версію браўзера з абмежаванай падтрымкай CSS.Для найлепшага вопыту мы рэкамендуем вам выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer).Акрамя таго, каб забяспечыць пастаянную падтрымку, мы паказваем сайт без стыляў і JavaScript.
Паўзункі, якія паказваюць тры артыкулы на слайдзе.Для перамяшчэння па слайдах выкарыстоўвайце кнопкі "Назад" і "Далей" або кнопкі кантролера слайдаў у канцы для перамяшчэння па кожным слайдзе.

Падрабязнае апісанне прадукту

304 з нержавеючай сталі зварныя спіральныя трубы / трубкі
1. Спецыфікацыя: змеявік з нержавеючай сталі / трубкі
2. Тып: зварныя або бясшвоўныя
3. Стандарт: ASTM A269, ASTM A249
4. Наружны дыяметр змеявіка з нержавеючай сталі: ад 6 да 25,4 мм
5. Даўжыня: 600-3500 мм або ў адпаведнасці з патрабаваннем кліента.
6. Таўшчыня сценкі: ад 0,2 мм да 2,0 мм.

7. Дапушчальнае адхіленне: OD: +/-0,01 мм;Таўшчыня: +/-0,01%.

8. Памер унутранага адтуліны шпулькі: 500-1500 мм (можна рэгуляваць у адпаведнасці з патрабаваннямі заказчыка)

9. Вышыня шпулькі: 200 мм-400 мм (можна рэгуляваць у адпаведнасці з патрабаваннямі заказчыка)

10. Паверхня: яркая або отожженная
11. Матэрыял: 304, 304L, 316L, 321, 301, 201, 202, 409, 430, 410, сплаў 625, 825, 2205, 2507 і г.д.
12. Упакоўка: плеценыя мяшкі ў драўляным футляры, драўляным паддоне, драўляным вале або ў адпаведнасці з патрабаваннем кліента
13. Тэст: хімічны кампанент, мяжа цякучасці, трываласць на разрыў, вымярэнне цвёрдасці
14. Гарантыя: праверка трэцяй асобай (напрыклад, SGS TV) і г.д.
15. Ужыванне: аздабленне, мэбля, транспарціроўка нафты, цеплаабменнік, выраб парэнчаў, выраб паперы, аўтамабільная прамысловасць, харчовая прамысловасць, медыцына і г.д.

Прыродныя мікробныя супольнасці філагенетычна і метабалічна разнастайныя.У дадатак да недастаткова вывучаных груп арганізмаў1, гэта разнастайнасць таксама мае багаты патэнцыял для адкрыцця экалагічна і біятэхналагічна значных ферментаў і біяхімічных злучэнняў2,3.Аднак вывучэнне гэтай разнастайнасці для вызначэння геномных шляхоў, якія сінтэзуюць такія злучэнні і звязваюць іх з адпаведнымі гаспадарамі, застаецца праблемай.Біясінтэтычны патэнцыял мікраарганізмаў у адкрытым акіяне застаецца ў значнай ступені невядомым з-за абмежаванняў у аналізе дадзеных раздзялення цэлага геному ў глабальным маштабе.Тут мы даследуем разнастайнасць і разнастайнасць кластараў біясінтэтычных генаў у акіяне, аб'ядноўваючы каля 10 000 мікробных геномаў з культывуемых клетак і асобных клетак з больш чым 25 000 нядаўна рэканструяваных чарнавых геномаў з больш чым 1000 узораў марской вады.Гэтыя намаганні ідэнтыфікавалі каля 40 000 меркаваных, у асноўным, новых біясінтэтычных кластараў генаў, некаторыя з якіх былі знойдзены ў раней не падазраваных філагенетычных групах.У гэтых папуляцыях мы ідэнтыфікавалі лінію, узбагачаную кластарамі біясінтэтычных генаў ("Candidatus Eudormicrobiaceae"), якія належалі да некультываванага тыпу бактэрый і ўключалі некаторыя з самых разнастайных у біясінтэтычным плане мікраарганізмаў у гэтым асяроддзі.З іх мы ахарактарызавалі фасфатаза-пептыдны і пітанамідны шляхі, выявіўшы асобнікі незвычайнай структуры біяактыўных злучэнняў і энзімалогіі адпаведна.У заключэнне, гэта даследаванне дэманструе, як стратэгіі, заснаваныя на мікрабіёмах, могуць даць магчымасць даследаваць раней неапісаныя ферменты і натуральныя прадукты ў дрэнна вывучанай мікрабіёце і навакольным асяроддзі.
Мікробы рухаюць глабальныя біягеахімічныя цыклы, падтрымліваюць харчовыя сеткі і падтрымліваюць здароўе раслін і жывёл5.Іх велізарная філагенетычная, метабалічная і функцыянальная разнастайнасць уяўляе сабой багаты патэнцыял для адкрыцця новых таксонаў1, ферментаў і біяхімічных злучэнняў, у тым ліку натуральных прадуктаў6.У экалагічных супольнасцях гэтыя малекулы забяспечваюць мікраарганізмы мноствам фізіялагічных і экалагічных функцый, ад зносін да канкурэнцыі 2, 7.У дадатак да сваіх першапачатковых функцый, гэтыя натуральныя прадукты і іх генетычна закадаваныя шляхі вытворчасці з'яўляюцца прыкладамі для біятэхналагічных і тэрапеўтычных прымянення 2,3.Ідэнтыфікацыі такіх шляхоў і сувязяў значна палегчыла вывучэнне культуры мікробаў.Аднак таксанамічныя даследаванні прыродных асяроддзяў паказалі, што пераважная большасць мікраарганізмаў не культываваліся8.Гэты культурны ўхіл абмяжоўвае нашу здольнасць выкарыстоўваць функцыянальную разнастайнасць, закадаваную многімі мікробамі4,9.
Каб пераадолець гэтыя абмежаванні, тэхналагічны прагрэс за апошняе дзесяцігоддзе дазволіў даследчыкам непасрэдна (г.зн. без папярэдняй культуры) секвенировать фрагменты мікробнай ДНК з цэлых суполак (метагеноміка) або асобных клетак.Магчымасць збіраць гэтыя фрагменты ў больш буйныя фрагменты геному і рэканструяваць некалькі метагеномна сабраных геномаў (MAG) або адзінкавыя ампліфікаваныя геномы (SAG), адпаведна, адкрывае важную магчымасць для таксацэнтрычных даследаванняў мікрабіёма (г.зн. мікробных супольнасцей і мікрабіёма).пракласці новыя шляхі.уласны генетычны матэрыял у дадзеным асяроддзі) 10,11,12.Сапраўды, нядаўнія даследаванні значна пашырылі філагенетычнае прадстаўленне разнастайнасці мікробаў на Зямлі1, 13 і выявілі вялікую частку функцыянальнай разнастайнасці ў асобных мікробных супольнасцях, якія раней не ахопліваліся паслядоўнасцямі эталоннага геному культывавання мікраарганізмаў (REF)14.Здольнасць размясціць нявыяўленае функцыянальнае разнастайнасць у кантэксце геному гаспадара (г.зн. дазвол геному) мае вырашальнае значэнне для прагназавання яшчэ неахарактарызаваных мікробных ліній, якія, як мяркуецца, кадуюць новыя прыродныя прадукты 15,16, або для адсочвання такіх злучэнняў да іх першапачатковага вытворцы 17.Напрыклад, камбінаваны метагеномны і аднаклетачны геномны падыход прывёў да ідэнтыфікацыі Candidatus Entotheonella, групы метабалічных бактэрый, звязаных з губкай, у якасці вытворцаў разнастайных лекавых патэнцыялаў18.Аднак, нягледзячы на ​​нядаўнія спробы геномных даследаванняў разнастайных мікробных супольнасцей,16,19 больш за дзве траціны глабальных метагеномных дадзеных для самага вялікага акіяна Зямлі экасістэм16,20 усё яшчэ адсутнічаюць.Такім чынам, у цэлым біясінтэтычны патэнцыял марскога мікрабіёма і яго патэнцыял як сховішча новых ферментатыўных і натуральных прадуктаў застаюцца ў значнай ступені недастаткова вывучанымі.
Каб вывучыць біясінтэтычны патэнцыял марскіх мікрабіёмаў у глабальным маштабе, мы спачатку аб'ядналі геномы марскіх мікробаў, атрыманыя з дапамогай культуразалежных і некультуральных метадаў, каб стварыць шырокую базу дадзеных па філагенетыцы і функцыях генаў.Вывучэнне гэтай базы дадзеных выявіла шырокі спектр біясінтэтычных кластараў генаў (BGC), большасць з якіх належаць да яшчэ неахарактарызаваных сем'яў кластараў генаў (GCF).Акрамя таго, мы ідэнтыфікавалі невядомае сямейства бактэрый, якое дэманструе самую вялікую з вядомых на сённяшні дзень разнастайнасць BGC у адкрытым акіяне.Мы абралі два шляху рыбасомнага сінтэзу і посттрансляцыйна мадыфікаванага пептыда (RiPP) для эксперыментальнай праверкі на падставе іх генетычных адрозненняў ад вядомых у цяперашні час шляхоў.Функцыянальная характарыстыка гэтых шляхоў выявіла нечаканыя прыклады энзімалогіі, а таксама структурна незвычайныя злучэнні з інгібітарнай актыўнасцю пратэазы.
Спачатку мы імкнуліся стварыць глабальны рэсурс дадзеных для аналізу геному, засяродзіўшы ўвагу на яго бактэрыяльных і археальных кампанентах.З гэтай мэтай мы аб'ядналі метагеномныя дадзеныя і 1038 узораў марской вады з 215 глабальна размеркаваных месцаў адбору пробаў (дыяпазон шырат = 141,6°) і некалькіх глыбокіх слаёў (ад 1 да 5600 м у глыбіню, якія ахопліваюць пелагічную, мезапелагічную і абісальную зоны).Фон21,22,23 (мал. 1а, пашыраныя дадзеныя, мал. 1а і дадатковая табліца 1).У дадатак да шырокага геаграфічнага ахопу гэтыя выбарачна адфільтраваныя ўзоры дазволілі нам параўнаць розныя кампаненты марскога мікрабіёма, у тым ліку багатыя вірусамі (<0,2 мкм), багатыя пракарыётамі (0,2–3 мкм), багатыя часціцамі (0,8 мкм). ).–20 мкм) і збедненыя вірусам (>0,2 мкм) калоніі.
a, Усяго 1038 агульнадаступных геномаў (метагеноміка) марскіх мікробных супольнасцей, сабраных з 215 глабальна распаўсюджаных месцаў (ад 62° паўднёвай да 79° паўночнай шыраты і ад 179° заходняй да 179° усходняй шыраты).Пліткі карты © Esri.Крыніцы: GEBCO, NOAA, CHS, OSU, UNH, CSUMB, National Geographic, DeLorme, NAVTEQ і Esri.b, гэтыя метагеномы выкарыстоўваліся для рэканструкцыі MAG (метады і дадатковая інфармацыя), якія адрозніваюцца па колькасці і якасці (метады) у наборах даных (пазначаныя колерам).Рэканструяваныя MAG былі дапоўнены агульнадаступнымі (знешнімі) геномамі, у тым ліку створанымі ўручную MAG26, SAG27 і REF.27 Скампілюйце OMD.c, у параўнанні з папярэднімі справаздачамі, заснаванымі толькі на SAG (GORG)20 або MAG (GEM)16, OMD паляпшае геномную характарыстыку марскіх мікробных супольнасцей (хуткасць метагеномнага адлюстравання чытання; метад) у два-тры разы з больш паслядоўным адлюстраваннем у глыбіні і шырата..<0,2, n=151, 0,2-0,8, n=67, 0,2-3, n=180, 0,8-20, n=30, >0,2, n=610, <30°, n=132, 30–60° , n = 73, >60°, n = 42, EPI, n = 174, MES, n = 45, BAT, n = 28. d, OMD, групоўка па відавых кластэрах (95% сярэдняя ідэнтычнасць нуклеатыдаў) вызначае агульную колькасць прыкладна 8300 відаў, больш за палову з якіх раней не характарызаваліся ў адпаведнасці з таксанамічнымі анатацыямі з выкарыстаннем GTDB (версія 89) e, класіфікацыя відаў па тыпу геному паказала, што MAG, SAG і REF добра дапаўняюць адзін аднаго, адлюстроўваючы філагенетычнае разнастайнасць марскі мікрабіём.У прыватнасці, 55%, 26% і 11% відаў былі спецыфічнымі для MAG, SAG і REF адпаведна.BATS, Бермудскія астравы Атлантычны часавы шэраг;GEM, геномы мікрабіёма Зямлі;GORG, эталонны геном глабальнага акіяна;ХОТ, серыял часу Гавайскага акіяна.
Выкарыстоўваючы гэты набор даных, мы рэканструявалі ў агульнай складанасці 26 293 MAG, у асноўным бактэрыяльных і археальных (мал. 1b і пашыраныя дадзеныя, мал. 1b).Мы стварылі гэтыя MAG з зборак з асобных, а не аб'яднаных метагеномных узораў, каб прадухіліць калапс натуральнай варыяцыі паслядоўнасці паміж узорамі з розных месцаў або момантаў часу (метадаў).Акрамя таго, мы згрупавалі геномныя фрагменты на аснове карэляцыі іх распаўсюджанасці ў вялікай колькасці ўзораў (ад 58 да 610 узораў, у залежнасці ад апытання; метаду).Мы выявілі, што гэта працаёмкі, але важны этап24, які быў прапушчаны падчас некалькіх буйнамаштабных работ па рэканструкцыі MAG16, 19, 25 і значна паляпшае колькасць (у сярэднім у 2,7 разы) і якасць (у сярэднім +20%) геном.рэканструяваны з даследаванага тут марскога метагенома (пашыраныя дадзеныя, мал. 2а і дадатковая інфармацыя).У цэлым гэтыя намаганні прывялі да 4,5-разовага павелічэння марскіх мікробных MAG (у 6 разоў, калі разглядаць толькі высакаякасныя MAG) у параўнанні з найбольш поўным рэсурсам MAG, даступным сёння16 (Метады).Затым гэты нядаўна створаны набор MAG быў аб'яднаны з 830 падабранымі ўручную MAG26, 5969 SAG27 і 1707 REF.Дваццаць сем відаў марскіх бактэрый і архей склалі камбінаторную калекцыю з 34 799 геномаў (мал. 1b).
Затым мы ацанілі нядаўна створаны рэсурс, каб палепшыць яго здольнасць прадстаўляць супольнасці марскіх мікробаў і ацаніць уплыў інтэграцыі розных тыпаў геному.У сярэднім мы выявілі, што ён ахоплівае прыкладна 40-60% марскіх метагеномных даных (малюнак 1c), што ў два-тры разы перавышае ахоп папярэдніх справаздач толькі MAG як па глыбіні, так і па шыраце Больш серыйны 16 або SAG20.Акрамя таго, для сістэматычнага вымярэння таксанамічнай разнастайнасці ў створаных калекцыях мы анатавалі ўсе геномы з дапамогай набору інструментаў (метадаў) Базы таксанамічных дадзеных геному (GTDB) і выкарысталі сярэднюю ідэнтычнасць нуклеатыдаў для ўсяго геному ў 95%.28 для ідэнтыфікацыі 8304 кластараў відаў (відаў).Дзве траціны гэтых відаў (уключаючы новыя клады) раней не з'яўляліся ў GTDB, з якіх 2790 былі знойдзены з дапамогай MAG, рэканструяванага ў гэтым даследаванні (мал. 1d).Акрамя таго, мы выявілі, што розныя тыпы геномаў вельмі ўзаемадапаўняльныя: 55%, 26% і 11% відаў цалкам складаюцца з MAG, SAG і REF адпаведна (мал. 1e).Акрамя таго, MAG ахоплівае ўсе 49 тыпаў, знойдзеных у тоўшчы вады, у той час як SAG і REF прадстаўляюць толькі 18 і 11 з іх адпаведна.Аднак SAG лепш адлюстроўвае разнастайнасць найбольш распаўсюджаных кладаў (пашыраныя дадзеныя, мал. 3a), такіх як Pelagic Bacteriales (SAR11), прычым SAG ахоплівае амаль 1300 відаў, а MAG - толькі 390 відаў.Характэрна, што REF рэдка перакрываюцца з MAG або SAG на відавым узроўні і прадстаўляюць >95% з прыблізна 1000 геномаў, якія не сустракаюцца ў вывучаных тут метагеномных наборах адкрытага акіяна, галоўным чынам з-за ўзаемадзеяння з іншымі тыпамі ізаляваных рэпрэзентатыўных марскіх узораў (напрыклад, адкладаў) .або гаспадар-паплечнік).Каб зрабіць яго шырока даступным для навуковай супольнасці, гэты рэсурс марскога геному, які таксама ўключае некласіфікаваныя фрагменты (напрыклад, з прадказаных фагаў, геномных астравоў і фрагментаў геному, для якіх недастаткова дадзеных для рэканструкцыі MAG), можна параўнаць з таксанамічнымі дадзенымі .Доступ да анатацый разам з функцыямі генаў і кантэкстнымі параметрамі ў базе даных мікрабіялогіі акіяна (OMD; https://microbiomics.io/ocean/).
Затым мы вырашылі даследаваць багацце і навізну біясінтэтычнага патэнцыялу мікрабіёмаў адкрытага акіяна.З гэтай мэтай мы спачатку выкарысталі antiSMASH для ўсіх MAG, SAG і REF, знойдзеных у 1038 марскіх метагеномах (метадах), каб прадказаць у агульнай складанасці 39 055 BGC.Затым мы згрупавалі іх у 6907 нерэзерваваных GCF і 151 папуляцыю кластараў генаў (GCC; Дадатковая табліца 2 і метады), каб улічыць унутраную надмернасць (г.зн. адзін і той жа BGC можа быць закадаваны ў некалькіх геномах) і метагеномныя дадзеныя Фрагментацыя канцэнтраваных BGC.Няпоўныя BGC істотна не павялічваюць колькасць GCF і GCC адпаведна, калі такія маюцца (дадатковая інфармацыя), якія змяшчаюць хаця б аднаго непашкоджанага члена BGC у 44% і 86% выпадкаў.
На ўзроўні GCC мы выявілі шырокі спектр прагназуемых RiPP і іншых натуральных прадуктаў (мал. 2а).Сярод іх, напрыклад, арилполиены, кароціноіды, эктоины і сідэрафоры належаць да GCC з шырокім філагенетычным распаўсюджваннем і высокай колькасцю ў акіянічных метагеномах, што можа сведчыць аб шырокай адаптацыі мікраарганізмаў да марскога асяроддзя, уключаючы ўстойлівасць да актыўных формаў кіслароду, акісляльны і асматычны стрэс..або паглынанне жалеза (дадатковая інфармацыя).Гэта функцыянальнае разнастайнасць кантрастуе з нядаўнім аналізам прыблізна 1,2 мільёна BGC сярод прыблізна 190 000 геномаў, якія захоўваюцца ў базе дадзеных NCBI RefSeq (BiG-FAM/RefSeq, у далейшым RefSeq)29, які паказаў, што нерибасомальные пептыды сінтэтазы (NRPS) і поликетидсинтаза (PKS) BGC (дадатковая інфармацыя).Мы таксама знайшлі 44 (29%) GCC толькі аддалена звязаныя з любым RefSeq BGC (\(\bar{d}\)RefSeq > 0,4; мал. 2a і метады) і 53 (35%) GCC толькі ў MAG, падкрэсліваючы патэнцыял для выяўлення раней неапісаных хімічных рэчываў у OMD.Улічваючы, што кожны з гэтых GCC, верагодна, прадстаўляе вельмі разнастайныя біясінтэтычныя функцыі, мы дадаткова прааналізавалі дадзеныя на ўзроўні GCF, спрабуючы забяспечыць больш дэталёвую групоўку BGC, паводле прагнозаў, для кадавання падобных натуральных прадуктаў29.У агульнай складанасці 3861 (56%) выяўлены GCF не перакрываўся з RefSeq, і >97% GCF не прысутнічалі ў MIBiG, адной з найбуйнейшых баз дадзеных эксперыментальна правераных BGC (малюнак 2b).Нягледзячы на ​​​​тое, што не дзіўна выявіць мноства патэнцыйных новых шляхоў ва ўмовах, якія недастаткова прадстаўлены эталонным геномам, наш метад дэрэплікацыі BGC у GCF перад параўнальным аналізам адрозніваецца ад папярэдніх справаздач 16 і дазваляе нам даць аб'ектыўную ацэнку навізны.Большая частка новай разнастайнасці (3012 GCF або 78%) адпавядае прадказаным тэрпенам, RiPP або іншым натуральным прадуктам, і большая частка (1815 GCF або 47%) закадзіравана ў невядомых тыпах з-за іх біясінтэтычнага патэнцыялу.У адрозненне ад кластараў PKS і NRPS, гэтыя кампактныя BGC з меншай верагоднасцю будуць фрагментаваны падчас метагеномнай зборкі 31 і дазваляюць больш патрабаваць часу і рэсурсаў для функцыянальнай характарыстыкі іх прадуктаў.
Усяго 39 055 BGC былі згрупаваны ў 6 907 GCF і 151 GCC.a, прадстаўленне даных (унутранае знешняе).Іерархічная кластэрызацыя адлегласцей BGC на аснове GCC, 53 з якіх фіксуюцца толькі MAG.GCC змяшчае BGC з розных таксонаў (ln-трансфармаваная частата варот) і розныя класы BGC (памер круга адпавядае яго частаце).Для кожнага GCC знешні ўзровень уяўляе колькасць BGC, распаўсюджанасць (працэнт узораў) і адлегласць (мінімальная косінусная адлегласць BGC (min(dMIBiG))) ад BiG-FAM да BGC.GCC з BGC, цесна звязанымі з эксперыментальна праверанымі BGC (MIBiG), вылучаны стрэлкамі.b Параўноўваючы GCF з прагназаванымі (BiG-FAM) і эксперыментальна праверанымі (MIBiG) BGC, быў знойдзены 3861 новы (d–>0,2) GCF.Большасць (78%) з іх кодуюць RiPP, тэрпены і іншыя меркаваныя натуральныя прадукты.c, усе геномы ў OMD, выяўленыя ў 1038 марскіх метагеномах, былі змешчаны ў базавае дрэва GTDB, каб паказаць філагенетычны ахоп OMD.Клады без геномаў у OMD паказаны шэрым колерам.Колькасць BGC адпавядае найбольшай колькасці прадказаных BGC на геном у дадзенай клады.Для нагляднасці апошнія 15% вузлоў згорнуты.Стрэлкі паказваюць клады, багатыя BGC (>15 BGC), за выключэннем Mycobacterium, Gordonia (другая пасля Rhodococcus) і Crocosphaera (другая пасля Synechococcus).д, Невядомы в.Eremiobacterota паказала найбольшую біясінтэтычную разнастайнасць (індэкс Шэнана, заснаваны на тыпе натуральнага прадукту).Кожная паласа прадстаўляе геном з найбольшай колькасцю BGC у відзе.Т1ПКС, ПКС тыпу I, Т2/3ПКС, ПКС тыпу II і тыпу III.
У дадатак да багацця і навізны, мы даследуем біягеаграфічную структуру биосинтетического патэнцыялу марскога микробиома.Групоўка ўзораў паводле сярэдняга метагеномнага размеркавання колькасці копій GCF (Метады) паказала, што суполкі ў нізкіх шыротах, на паверхні, багатыя пракарыётамі і бедныя вірусамі, у асноўным з паверхневых або глыбей асветленых сонцам вод, былі багатыя тэрпенамі RiPP і BGC.Наадварот, палярныя, глыбакаводныя, багатыя вірусамі і часціцамі суполкі былі звязаны з большай колькасцю NRPS і PKS BGC (пашыраныя дадзеныя, мал. 4 і дадатковая інфармацыя).Нарэшце, мы выявілі, што добра вывучаныя трапічныя і пелагічныя супольнасці з'яўляюцца найбольш перспектыўнымі крыніцамі новых тэрпенаў (малюнак з дапоўненымі дадзенымі).Самы высокі патэнцыял для PKS, RiPP і іншых натуральных прадуктаў (малюнак 5a з пашыранымі дадзенымі).
Каб дапоўніць наша даследаванне біясінтэтычнага патэнцыялу марскіх мікрабіёмаў, мы імкнуліся скласці карту іх філагенетычнага размеркавання і вызначыць новыя клады, узбагачаныя BGC.З гэтай мэтай мы змясцілі геномы марскіх мікробаў у нармалізаванае бактэрыяльнае і архейнае філагенетычнае дрэва GTDB13 і наклалі меркаваныя біясінтэтычныя шляху, якія яны кадуюць (мал. 2c).Мы лёгка выявілі некалькі ўзбагачаных BGC кладаў (прадстаўленых больш чым 15 BGC) у пробах марской вады (метады), вядомых сваім біясінтэтычным патэнцыялам, такіх як цыянабактэрыі (Synechococcus) і бактэрыі Proteus, такія як Tistrella32,33, або нядаўна прыцягнулі ўвагу сваімі натуральныя прадукты.такія як Myxococcota (Sandaracinaceae), Rhodococcus і Planctomycetota34,35,36.Цікава, што ў гэтых кладах мы знайшлі некалькі раней недаследаваных ліній.Напрыклад, віды з найбагацейшым біясінтэтычным патэнцыялам у тыпах Planctomycetota і Myxococcota належалі да неахарактарызаваных атрадаў кандыдатаў і родаў адпаведна (дадатковая табліца 3).У сукупнасці гэта сведчыць аб тым, што OMD забяспечвае доступ да раней невядомай філагенетычнай інфармацыі, уключаючы мікраарганізмы, якія могуць прадстаўляць новыя мішэні для адкрыцця ферментаў і прыродных прадуктаў.
Далей мы ахарактарызавалі ўзбагачаную BGC кладу, не толькі падлічыўшы максімальную колькасць BGC, закадзіраваных яе членамі, але таксама ацаніўшы разнастайнасць гэтых BGC, што тлумачыць частату розных тыпаў прыродных прадуктаў-кандыдатаў (мал. 2c і метады )..Мы выявілі, што ў гэтым даследаванні найбольш біясінтэтычна разнастайныя віды былі прадстаўлены спецыяльна распрацаванымі бактэрыяльнымі MAG.Гэтыя бактэрыі належаць да некультываванага тыпу Candidatus Eremiobacterota, які застаецца ў значнай ступені недаследаваным, за выключэннем некалькіх геномных даследаванняў37,38.Характэрна, што «бл.Род Eremiobacterota быў прааналізаваны толькі ў наземным асяроддзі39 і не вядома, каб уключаць членаў, узбагачаных BGC.Тут мы рэканструявалі восем MAG аднаго і таго ж віду (ідэнтычнасць нуклеатыдаў> 99%) 23. Таму мы прапануем відавую назву "Candidatus Eudoremicrobium malaspinii", названую ў гонар нерэіды (марской німфы), прыгожага падарунка ў грэцкай міфалогіі і экспедыцыях.'Ка.Згодна з філагенетычнай анатацыяй 13, E. malaspinii не мае раней вядомых сваякоў ніжэй за ўзровень паслядоўнасці і, такім чынам, належыць да новага сямейства бактэрый, якое мы прапануем «Ca.E. malaspinii» як тыпавы від і «Ca.Eudormicrobiaceae» у якасці афіцыйнай назвы (дадатковая інфармацыя).Кароткая метагеномная рэканструкцыя 'Ca.Праект геному E. malaspinii быў пацверджаны метагеномным секвенаваннем з вельмі нізкім уводам, доўгім чытаннем і мэтанакіраванай зборкай аднаго ўзору (метады) у выглядзе адной лінейнай храмасомы памерам 9,63 Мб з дубліраваннем памерам 75 кб.як адзіная засталася неадназначнасць.
Каб усталяваць філагенетычны кантэкст гэтага віду, мы шукалі 40 блізкароднасных відаў у дадатковых метагеномных узорах, узбагачаных эукарыётамі, з экспедыцыі ў акіяне Тара з дапамогай мэтанакіраванай рэканструкцыі геному.Карацей кажучы, мы звязалі метагеномныя чытанні з геномнымі фрагментамі, звязанымі з «Ca.E. malaspinii» і выказаў здагадку, што павышаны ўзровень вярбоўкі ў гэтай выбарцы сведчыць аб наяўнасці іншых сваякоў (метады).У выніку мы знайшлі 10 MAG, камбінацыю з 19 MAG, якія прадстаўляюць пяць відаў у трох родах у рамках нядаўна вызначанай сям'і (напрыклад, "Ca. Eudormicrobiaceae").Пасля ручной праверкі і кантролю якасці (разгорнутыя дадзеныя, мал. 6 і дадатковая інфармацыя) мы выявілі, што «Ca.Віды Eudormicrobiaceae маюць большы геном (8 Mb) і больш багаты біясінтэтычны патэнцыял (ад 14 да 22 BGC на від), чым іншыя члены «Ca».Клада Eremiobacterota (да 7 BGC) (мал. 3a–c).
a, Філагенетычныя пазіцыі пяці 'Ca.Віды Eudormicrobiaceae паказалі багацце BGC, характэрнае для марскіх ліній, выяўленых у гэтым даследаванні.Філагенетычнае дрэва ўключае ўсе 'Ca.MAG Eremiobacterota і члены іншых тыпаў (нумары геному ў дужках), прыведзеныя ў GTDB (версія 89), выкарыстоўваліся для эвалюцыйнага фону (метады).Самыя знешнія пласты прадстаўляюць класіфікацыі на ўзроўні сямейства ("Ca. Eudormicrobiaceae" і "Ca. Xenobiaceae") і на ўзроўні класа ("Ca. Eremiobacteria").Пяць відаў, апісаных у гэтым даследаванні, прадстаўлены літарна-лічбавымі кодамі і прапанаванымі бінамінальнымі назвамі (дадатковая інфармацыя).б, добра.Віды Eudormicrobiaceae маюць сем агульных ядраў BGC.Адсутнасць BGC у кладзе A2 была звязана з няпоўнасцю рэпрэзентатыўнага MAG (дадатковая табліца 3).BGC характэрныя для “Ca.Amphithomicrobium» і «Ca.Amphithomicrobium» (клады А і Б) не паказаны.c, усе BGC, закадаваныя як «Ca.Было выяўлена, што Eudoremicrobium taraoceanii выяўляецца ў 623 метатранскриптомах, узятых з акіянаў Тары.Суцэльныя кружочкі паказваюць на актыўную транскрыпцыю.Аранжавыя кружочкі абазначаюць log2-трансфармаваныя змены зморшчыны ніжэй і вышэй хуткасці экспрэсіі гена гаспадаркі (метады).d, крывыя адноснай колькасці (метады), якія паказваюць 'Ca.Віды Eudormicrobiaceae шырока распаўсюджаны ў большасці акіянскіх басейнаў і ва ўсёй тоўшчы вады (ад паверхні да глыбіні не менш за 4000 м).На аснове гэтых ацэнак мы выявілі, што «Ка.На E. malaspinii прыходзіцца да 6% пракарыётычных клетак у глыбакаводных пелагічных супольнасцях, звязаных са збожжам.Мы лічылі від прысутным на месцы, калі ён быў знойдзены ў любой долі памеру дадзенага глыбіннага пласта.IO – Індыйскі акіян, NAO – Паўночная Атлантыка, NPO – Паўночная частка Ціхага акіяна, RS – Чырвонае мора, SAO – Паўднёвая Атлантыка, SO – Паўднёвы акіян, SPO – Паўднёвая частка Ціхага акіяна.
Вывучэнне колькасці і размеркавання Ca.Eudormicrobiaceae, які, як мы высветлілі, пераважае ў большасці акіянічных басейнаў, а таксама ва ўсёй тоўшчы вады (мал. 3d).На мясцовым узроўні яны складаюць 6% марской мікробнай супольнасці, што робіць іх важнай часткай глабальнага марскога мікрабіёма.Акрамя таго, мы выявілі адноснае ўтрыманне Ca.Віды Eudormicrobiaceae і іх узровень экспрэсіі BGC былі самымі высокімі ва ўзбагачанай фракцыі эўкарыётаў (мал. 3c і пашыраныя дадзеныя, мал. 7), што паказвае на магчымае ўзаемадзеянне з цвёрдымі часціцамі, уключаючы планктон.Гэта назіранне мае некаторае падабенства з 'Ca.BGC Eudoremicrobium, якія выпрацоўваюць цытатоксічнае натуральныя прадукты вядомымі шляхамі, могуць праяўляць драпежныя паводзіны (дадатковая інфармацыя і пашыраныя даныя, малюнак 8), падобныя на іншых драпежнікаў, якія спецыяльна выпрацоўваюць метабаліты, такія як Myxococcus41.Адкрыццё Ca.Eudormicrobiaceae у менш даступных (глыбокі акіян) або эўкарыётычных, а не пракарыётычных узорах можа растлумачыць, чаму гэтыя бактэрыі і іх нечаканая разнастайнасць BGC застаюцца незразумелымі ў кантэксце даследаванняў натуральнай ежы.
У рэшце рэшт, мы імкнуліся эксперыментальна пацвердзіць магчымасці нашай працы, заснаванай на мікрабіёмах, у адкрыцці новых шляхоў, ферментаў і натуральных прадуктаў.Сярод розных класаў BGC шлях RiPP, як вядома, кадуе багатую хімічную і функцыянальную разнастайнасць з-за розных посттрансляцыйных мадыфікацый асноўнага пептыда спелымі ферментамі42.Такім чынам, мы выбралі два "Ка.Eudoremicrobium' RiPP BGC (рысункі 3b і 4a-e) заснаваны на тым жа самым, што і любы вядомы BGC (\(\bar{d}\)MIBiG і \(\bar{d}\)RefSeq вышэй 0,2).
a–c, Гетэралагічная экспрэсія in vitro і ферментатыўныя аналізы in vitro новага (\(\bar{d}\)RefSeq = 0,29) кластара біясінтэзу RiPP, характэрнага для глыбакаводных відаў Ca.E. malaspinii' прывялі да вытворчасці дифосфорилированных прадуктаў.c, мадыфікацыі, ідэнтыфікаваныя з выкарыстаннем высокага раздзялення (HR) MS/MS (фрагментацыя паказана іёнамі b і y у хімічнай структуры) і ЯМР (пашыраныя дадзеныя, мал. 9).d, гэты фасфарыляваны пептыд дэманструе нізкае мікрамалярнае інгібіраванне эластазы нейтрофілов млекакормячых, чаго няма ў кантрольным пептыдзе і дэгідратацыйным пептыдзе (дэгідратацыя, выкліканая хімічным выдаленнем).Эксперымент паўтаралі тры разы з аналагічнымі вынікамі.Напрыклад, гетэралагічная экспрэсія другога новага \(\bar{d}\)RefSeq = 0,33) кластара біясінтэзу бялку высвятляе функцыю чатырох спелых ферментаў, якія мадыфікуюць пептыд ядра з 46 амінакіслот.Рэшткі афарбоўваюцца ў адпаведнасці з месцам мадыфікацыі, прадказаным з дапамогай HR-MS/MS, маркіроўкі ізатопаў і аналізу ЯМР (дадатковая інфармацыя).Пункцірная афарбоўка паказвае, што мадыфікацыя адбываецца ў любым з двух астаткаў.Малюнак уяўляе сабой кампіляцыю шматлікіх гетэралагічных канструкцый, каб паказаць актыўнасць усіх спелых ферментаў на адным і тым жа ядры.h, Ілюстрацыя даных ЯМР для асноўнага аміднага N-метылявання.Поўныя вынікі паказаны на мал.10 з пашыранымі дадзенымі.i, Філагенетычнае становішча спелага кластарнага фермента бялку FkbM сярод усіх даменаў FkbM, знойдзеных у базе дадзеных MIBiG 2.0, паказвае фермент гэтага сямейства з актыўнасцю N-метилтрансферазы (дадатковая інфармацыя).Паказаны прынцыповыя дыяграмы BGCs (a, e), структур пептыдаў-папярэднікаў (b, f) і меркаваных хімічных структур натуральных прадуктаў (c, g).
Першы шлях RiPP (\(\bar{d}\)MIBiG = 0,41, \(\bar{d}\)RefSeq = 0,29) быў знойдзены толькі ў глыбакаводных відаў «Ca.E. malaspinii» і коды для папярэдніка пептыда (мал. 4а, б).У гэтым сталым ферменте мы вызначылі адзіны функцыянальны дамен, гамалагічныя дамену дэгідратацыі лантыпептыдсінтазы, які звычайна каталізуе фасфараляванне і наступнае выдаленне 43 (дадатковая інфармацыя).Такім чынам, мы прагназуем, што мадыфікацыя пептыда-папярэдніка прадугледжвае такую ​​двухступеньчатую дэгідратацыю.Аднак з дапамогай тандэмнай мас-спектраметрыі (МС/МС) і спектраскапіі ядзернага магнітнага рэзанансу (ЯМР) мы вызначылі полифосфорилированный лінейны пептыда (мал. 4с).Нягледзячы на ​​тое, што гэта было нечакана, мы знайшлі некалькі ліній доказаў, якія пацвярджаюць, што гэта канчатковы прадукт: два розныя гетэралагічныя гаспадары і адсутнасць абязводжвання ў аналізах in vitro, ідэнтыфікацыя ключавых астаткаў, мутаваных у месцы каталітычнай дэгідратацыі спелага фермента.усё рэканструявана “Ca”.Геном E. malaspinii (разгорнутыя дадзеныя, мал. 9 і дадатковая інфармацыя) і, нарэшце, біялагічная актыўнасць фасфарыляванага прадукту, але не хімічна сінтэзаванай абязводжанай формы (мал. 4d).Фактычна, мы выявілі, што ён дэманструе нізкую микромолярную інгібітарную актыўнасць протеазы супраць эластазы нейтрофілов, параўнальную з іншымі роднаснымі прыроднымі прадуктамі ў дыяпазоне канцэнтрацый (IC50 = 14,3 мкМ) 44, нягледзячы на ​​тое, што экалагічная роля яшчэ не высветлена.Грунтуючыся на гэтых выніках, мы прапануем назваць шлях «фосфептин».
Другі выпадак - гэта складаны шлях RiPP, характэрны для 'Ca.Было прадказана, што род Eudoremicrobium (\(\bar{d}\)MIBiG = 0,46, \(\bar{d}\)RefSeq = 0,33) кадуе натуральныя бялковыя прадукты (мал. 4e).Гэтыя шляхі ўяўляюць асаблівую біятэхналагічную цікавасць з-за чаканай шчыльнасці і разнастайнасці незвычайных хімічных мадыфікацый, створаных ферментамі, якія кадуюцца адносна кароткімі BGCs45.Мы выявілі, што гэты бялок адрозніваецца ад раней ахарактарызаваных бялкоў тым, што ў ім адсутнічае як асноўны матыў NX5N полицерамидов, так і лантиониновая пятля ландорнамидов 46 .Каб пераадолець абмежаванні агульных гетэралагічных мадэляў экспрэсіі, мы выкарыстоўвалі іх разам са спецыяльнай сістэмай Microvirgula aerodenitrificans для характарыстыкі чатырох спелых ферментаў (метадаў).Выкарыстоўваючы камбінацыю MS/MS, ізатопнай маркіроўкі і ЯМР, мы выявілі гэтыя спелыя ферменты ў 46-амінакіслотным ядры пептыда (мал. 4f, g, пашыраныя дадзеныя, мал. 10-12 і дадатковая інфармацыя).Сярод спелых ферментаў мы ахарактарызавалі першае з'яўленне члена сямейства FkbM O-метилтрансферазы 47 у шляху RiPP і нечакана выявілі, што гэты спелы фермент уводзіць асноўнае N-метилирование (мал. 4h, i і дадатковая інфармацыя).Нягледзячы на ​​тое, што гэтая мадыфікацыя вядомая ў натуральных прадуктах NRP48, ферментатыўнае N-метыляванне амідных сувязяў з'яўляецца складанай, але біятэхналагічна значнай рэакцыяй49, якая да гэтага часу ўяўляла цікавасць для сямейства борозинов RiPP.Спецыфічнасць 50,51.Ідэнтыфікацыя гэтай актыўнасці ў іншых сямействах ферментаў і RiPP можа адкрыць новыя прыкладання і пашырыць функцыянальную разнастайнасць бялкоў 52 і іх хімічную разнастайнасць.На падставе выяўленых мадыфікацый і незвычайнай даўжыні прапанаванай структуры прадукту мы прапануем назву шляху «пітанамід».
Адкрыццё нечаканай энзімалогіі ў функцыянальна ахарактарызаваным сямействе ферментаў паказвае перспектыўнасць геномікі навакольнага асяроддзя для новых адкрыццяў, а таксама ілюструе абмежаваныя магчымасці для функцыянальных высноў, заснаваных толькі на гамалогіі паслядоўнасці.Такім чынам, разам з паведамленнямі аб некананічных біяактыўных поліфасфарыляваных RiPP, нашы вынікі дэманструюць рэсурсаёмістую, але крытычную каштоўнасць для намаганняў сінтэтычнай біялогіі, каб цалкам раскрыць функцыянальнае багацце, разнастайнасць і незвычайныя структуры біяхімічных злучэнняў.
Тут мы дэманструем спектр біясінтэтычнага патэнцыялу, закадзіраванага мікробамі, і іх геномны кантэкст у глабальным марскім мікрабіёме, палягчаючы будучыя даследаванні, робячы атрыманы рэсурс даступным для навуковай супольнасці (https://microbiomics.io/ocean/).Мы выявілі, што большая частка яго філагенетычнай і функцыянальнай навізны можа быць атрымана толькі шляхам рэканструкцыі MAG і SAG, асабліва ў недастаткова выкарыстоўваных мікробных супольнасцях, якія могуць накіроўваць будучыя намаганні па біяразведцы.Хаця мы засяродзімся тут на «Ca.Eudormicrobiaceae» як лінія, асабліва біясінтэтычна «таленавітая», многія з BGC, прадказаныя ў нераскрытай мікрабіёце, верагодна, кадуюць раней неапісаныя энзімалогіі, якія даюць злучэнні з экалагічна і/або біятэхналагічна значным дзеяннем.
Наборы метагеномных даных з асноўных акіянаграфічных даследаванняў і даследаванняў часовых шэрагаў з дастатковай глыбінёй секвеніравання былі ўключаны, каб максымізаваць ахоп глабальных марскіх мікробных супольнасцей у басейнах акіяна, глыбокіх пластах і з цягам часу.Гэтыя наборы даных (дадатковая табліца 1 і малюнак 1) уключаюць метагенаміку з узораў, сабраных у акіянах Тары (узбагачаны вірусамі, n=190; узбагачаны пракарыётамі, n=180)12,22 і экспедыцыі BioGEOTRACES (n=480).Гавайскі акіянічны часовы шэраг (HOT, n = 68), Бермудска-Атлантычны часовы шэраг (BATS, n = 62)21 і Маласпінская экспедыцыя (n = 58)23.Счытванні секвенирования з усіх метагеномных фрагментаў былі адфільтраваны на якасць з дапамогай BBMap (v.38.71) шляхам выдалення адаптараў секвенирования з чытанняў, выдалення чытанняў, адлюстраваных на паслядоўнасці кантролю якасці (геномы PhiX), і выкарыстання trimq=14, maq=20 адхіляе дрэнную якасць чытання, maxns = 0 і minlength = 45. Наступныя аналізы праводзіліся або аб'ядноўваліся з паказаннямі КК, калі гэта было пазначана (bbmerge.sh minoverlap=16).Паказчыкі кантролю якасці былі нармалізаваны (bbnorm.sh target = 40, minddepth = 0) перад зборкай з выкарыстаннем metaSPAdes (v.3.11.1 або v.3.12, калі неабходна)53.Атрыманыя кантыгі каркаса (далей названыя каркасамі) былі канчаткова адфільтраваны па даўжыні (≥1 кб).
1038 метагеномных узораў былі падзелены на групы, і для кожнай групы ўзораў паказанні метагеномнага кантролю якасці ўсіх узораў былі супастаўлены з дужкамі кожнага ўзору асобна, што прывяло да наступнай колькасці парных у дужках групавых паказанняў: марскія вірусы Тара – узбагачаны (190×190 ), Prokariotes Enriched (180×180), BioGEOTRACES, HOT and BATS (610×610) і Malaspina (58×58).Адлюстраванне было зроблена з дапамогай Burrows-Wheeler-Aligner (BWA) (v.0.7.17-r1188)54, які дазваляе супастаўляць паказанні з другаснымі сайтамі (з выкарыстаннем сцяга -a).Выраўноўванні былі адфільтраваны так, каб яны мелі даўжыню не менш за 45 баз, мелі ≥97% ідэнтычнасці і ахоплівалі ≥80% чытанняў.Атрыманыя файлы BAM былі апрацаваны з дапамогай сцэнарыя jgi_summarize_bam_contig_depths для MetaBAT2 (v.2.12.1)55, каб забяспечыць унутры- і міжвыбаркавы ахоп для кожнай групы.Нарэшце, дужкі былі згрупаваны для павышэння адчувальнасці шляхам індывідуальнага запуску MetaBAT2 на ўсіх узорах з –minContig 2000 і –maxEdges 500. Мы выкарыстоўваем MetaBAT2 замест ансамблевага баксёра, таму што незалежныя тэсты паказалі, што гэта найбольш эфектыўны адзіночны баксёр.і ад 10 да 50 разоў хутчэй, чым іншыя звычайна выкарыстоўваюцца баксёры57.Каб праверыць уплыў карэляцыі колькасці, у выпадкова выбранай падвыбарцы метагеномікі (10 для кожнага з двух набораў даных акіяна Тара, 10 для BioGEOTRACES, 5 для кожнага часовага шэрагу і 5 для Маласпіны) дадаткова выкарыстоўваліся толькі ўзоры.Унутраныя выбаркі групуюцца для атрымання інфармацыі аб ахопе.(Дадатковая інфармацыя).
У наступны аналіз былі ўключаны дадатковыя (знешнія) геномы, а менавіта 830 выбраных уручную MAG з падмноства набору даных Tara Oceans26, 5287 SAG з набору даных GORG20 і даныя з базы дадзеных MAR (MarDB v. 4) з 1707 ізаляваных REF і 682 SAG) 27. Для набору даных MarDB геномы выбіраюцца на аснове даступных метададзеных, калі тып выбаркі адпавядае наступнаму рэгулярнаму выразу: '[S|s]single.?[C|c]ell|[C|c]ulture| [I|i] ізаляваны'.
Якасць кожнага метагеномнага кантэйнера і знешніх геномаў ацэньвалася з дапамогай CheckM (v.1.0.13) і Anvi'o's Lineage Workflow (v.5.5.0)58,59.Калі CheckM або Anvi'o паведамляе аб ≥50% паўнаце/паўнаце і ≤10% забруджванні/надмернасці, то захавайце метагеномныя клеткі і знешнія геномы для наступнага аналізу.Затым гэтыя балы былі аб'яднаны ў сярэднюю паўнату (mcpl) і сярэдняе забруджванне (mctn), каб класіфікаваць якасць геному ў адпаведнасці з крытэрыямі супольнасці60 наступным чынам: высокая якасць: mcpl ≥ 90% і mctn ≤ 5%;добрая якасць: mcpl ≥ 70%, mctn ≤ 10%, сярэдняя якасць: mcpl ≥ 50% і mctn ≤ 10%, добрая якасць: mcpl ≤ 90% або mctn ≥ 10%.Затым адфільтраваныя геномы суадносілі з паказчыкамі якасці (Q і Q') наступным чынам: Q = mcpl – 5 x mctn Q' = mcpl – 5 x mctn + mctn x (зменлівасць штаму)/100 + 0,5 x log[N50].(рэалізавана ў dRep61).
Для правядзення параўнальнага аналізу паміж рознымі крыніцамі даных і тыпамі геному (MAG, SAG і REF), 34 799 геномаў былі разыменаваны на аснове агульнагеномнай сярэдняй ідэнтычнасці нуклеатыдаў (ANI) з дапамогай dRep (v.2.5.4).Паўтары)61 ​​з 95% парогавымі значэннямі ANI28,62 (-comp 0 -con 1000 -sa 0,95 -nc 0,2) і генамі-маркерамі ў адной копіі з выкарыстаннем SpecI63, забяспечваючы кластэрызацыю геному на відавым узроўні.Рэпрэзентатыўны геном быў абраны для кожнага кластара dRep у адпаведнасці з максімальным балам якасці (Q'), вызначаным вышэй, які лічыўся рэпрэзентатыўным для віду.
Для ацэнкі хуткасці адлюстравання BWA (v.0.7.17-r1188, -a) выкарыстоўваўся для адлюстравання ўсіх 1038 набораў метагеномных чытанняў з 34 799 геномамі, якія змяшчаюцца ў OMD.Счытванні з кантролем якасці былі адлюстраваны ў аднаканцовым рэжыме, а атрыманыя выраўноўванні былі адфільтраваны, каб захаваць толькі выраўноўванні даўжынёй ≥45 пн.і ідэнтычнасць ≥95%.Каэфіцыент адлюстравання для кожнага ўзору - гэта працэнт паказанняў, якія засталіся пасля фільтрацыі, падзелены на агульную колькасць паказанняў кантролю якасці.Выкарыстоўваючы той жа падыход, кожны з 1038 метагеномаў быў скарочаны да 5 мільёнаў уставак (разгорнутыя дадзеныя, мал. 1c) і супастаўлены з GORG SAG у OMD і ва ўсіх GEM16.Колькасць MAG, вынятая з марской вады ў каталогу GEM16, вызначалася па ключавых запытах метагеномных крыніц, адбіраючы ўзоры марской вады (напрыклад, у адрозненне ад марскіх адкладаў).У прыватнасці, мы выбіраем «aquatic» як «ecosystem_category», «marine» як «ecosystem_type», і фільтруем «habitat» як «deep ocean», «marine», «maritime oceanic», «pelagic marine», «marine water» , «Акіян», «Марская вада», «Паверхневая марская вада», «Паверхневая марская вада».Гэта прывяло да 5903 MAG (734 высокай якасці), размеркаваных па 1823 OTU (прагляды тут).
Геномы пракарыётаў былі таксанамічна анатаваны з выкарыстаннем GTDB-Tk (v.1.0.2)64 з параметрамі па змаўчанні, накіраванымі на GTDB r89 версіі 13. Anvi'o выкарыстоўваўся для ідэнтыфікацыі геномаў эўкарыётаў на аснове прагназавання дамена і запамінання ≥50% і празмернасці ≤ 10%.Таксанамічная анатацыя віду вызначаецца як адзін з яго рэпрэзентатыўных геномаў.За выключэннем эукарыёт (148 MAG), кожны геном быў спачатку функцыянальна анатаваны з дапамогай prokka (v.1.14.5)65, называючы поўныя гены, вызначаючы параметры «архей» або «бактэрыі» па меры неабходнасці, што таксама паведамляецца для не- кадавальныя гены.і рэгіёны CRISPR, сярод іншых геномных асаблівасцей.Анатаваць прагназаваныя гены шляхам ідэнтыфікацыі генаў універсальных аднакопійных маркераў (uscMG) з дапамогай fetchMG (v.1.2)66, прызначаць групы арталагаў і запытваць з дапамогай emapper (v.2.0.1)67 на аснове eggNOG (v.5.0)68.База дадзеных KEGG (апублікавана 10 лютага 2020 г.) 69. Апошні этап быў выкананы шляхам супастаўлення бялкоў з базай дадзеных KEGG з выкарыстаннем DIAMOND (v.0.9.30)70 з ахопам запытаў і тэм ≥70%.Вынікі былі дадаткова адфільтраваны ў адпаведнасці з NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline71 на аснове бітрэйту ≥ 50% ад максімальнага чаканага бітрэйту (сама спасылка).Паслядоўнасці генаў таксама выкарыстоўваліся ў якасці ўваходных дадзеных для ідэнтыфікацыі BGC ў геноме з дапамогай antiSMASH (v.5.1.0)72 з параметрамі па змаўчанні і рознымі выбухамі кластараў.Усе геномы і анатацыі былі сабраны ў OMD разам з кантэкстнымі метададзенымі, даступнымі ў Інтэрнэце (https://microbiomics.io/ocean/).
Падобна раней апісаным метадам12,22, мы выкарыстоўвалі CD-HIT (v.4.8.1) для згрупавання >56,6 мільёнаў генаў, якія кадуюць бялок з бактэрыяльных і архейных геномаў з OMD, у 95% ідэнтычнасць і больш кароткія гены (90% ахоп)73 да >17,7 мільёнаў кластараў генаў.Самая доўгая паслядоўнасць была абраная ў якасці рэпрэзентатыўнага гена для кожнага кластара генаў.Затым 1038 метагеномаў былі супастаўлены з >17,7 мільёнамі членаў кластара BWA (-a), а атрыманыя файлы BAM былі адфільтраваны, каб захаваць толькі выраўноўванні з ≥95% адсоткавай ідэнтычнасці і ≥45 базавых выраўноўванняў.Нармалізаваная па даўжыні колькасць генаў была разлічана шляхам спачатку падліку ўставак з найлепшага унікальнага выраўноўвання, а затым, для недакладна адлюстраваных уставак, дадання дробавых падлікаў да адпаведных генаў-мішэняў, прапарцыйных іх колькасці унікальных уставак.
Геномы з пашыранага OMD (з дадатковымі MAG з «Ca. Eudormicrobiaceae», гл. ніжэй) былі дададзены ў базу дадзеных інструмента метагеномнага аналізу mOTUs74 (версія 2.5.1), каб стварыць пашыраную даведачную базу дадзеных mOTU.Толькі шэсць аднакопійных геномаў (23 528 геномаў) выжылі з дзесяці uscMG.Пашырэнне базы даных прывяло да 4494 дадатковых кластараў на відавым узроўні.1038 метагеномаў былі прааналізаваны з выкарыстаннем параметраў mOTU па змаўчанні (v.2).У агульнай складанасці 989 геномаў, якія змяшчаюцца ў 644 кластарах mOTU (95% REF, 5% SAG і 99,9% належаць MarDB), не былі выяўлены профілем mOTU.Гэта адлюстроўвае розныя дадатковыя крыніцы марской ізаляцыі геномаў MarDB (большасць невыяўленых геномаў звязана з арганізмамі, выдзеленымі з адкладаў, марскімі гаспадарамі і г.д.).Каб працягваць засяроджвацца на асяроддзі адкрытага акіяна ў гэтым даследаванні, мы выключылі іх з далейшага аналізу, калі яны не былі выяўленыя або ўключаны ў пашыраную базу дадзеных mOTU, створаную ў гэтым даследаванні.
Усе BGC з MAG, SAG і REF у OMD (гл. вышэй) былі аб'яднаны з BGC, ідэнтыфікаванымі ва ўсіх метагеномных каркасах (antiSMASH v.5.0, параметры па змаўчанні) і ахарактарызаваны з дапамогай BiG-SLICE (v.1.1) (дамен PFAM)75.Грунтуючыся на гэтых асаблівасцях, мы вылічылі ўсе косінусныя адлегласці паміж BGC і згрупавалі іх (сярэднія сувязі) у GCF і GCC, выкарыстоўваючы парогавыя значэнні адлегласці 0,2 і 0,8 адпаведна.Гэтыя парогавыя значэнні з'яўляюцца адаптацыяй парогавых значэнняў, якія раней выкарыстоўваліся з выкарыстаннем эўклідавай адлегласці75 разам з косінуснай адлегласцю, што змякчае некаторыя памылкі ў першапачатковай стратэгіі кластарызацыі BiG-SLICE (дадатковая інфармацыя).
Затым BGC былі адфільтраваны, каб захаваць толькі ≥5 кб, закадаваныя на каркасах, каб знізіць рызыку фрагментацыі, як апісана раней16, і выключыць MarDB REF і SAG, якія не знойдзены ў 1038 метагеномах (гл. вышэй).Гэта прывяло да таго, што ў агульнай складанасці 39 055 BGC былі закадзіраваны геномам OMD, з дадатковымі 14 106 ідэнтыфікаванымі на метагеномных фрагментах (г.зн. не аб'яднаных у MAG).Гэтыя «метагеномныя» BGC выкарыстоўваліся для ацэнкі долі патэнцыялу біясінтэзу марскога мікрабіёма, не зафіксаванага ў базе даных (дадатковая інфармацыя).Кожны BGC быў функцыянальна ахарактарызаваны ў адпаведнасці з прадказальнымі тыпамі прадуктаў, вызначанымі анты-SMASH або больш грубымі катэгорыямі прадуктаў, вызначанымі ў BiG-SCAPE76.Каб прадухіліць хібнасць выбаркі ў колькаснай ацэнцы (таксанамічны і функцыянальны склад GCC/GCF, адлегласць GCF і GCC да эталонных баз даных і метагеномная колькасць GCF), захоўваючы толькі самы доўгі BGC на GCF для кожнага віду, 39 055 BGC былі дадаткова дэдуплікаваны, у выніку ў агульнай складанасці 17 689 BGC.
Навізна GCC і GCF ацэньвалася на аснове адлегласці паміж разліковай базай дадзеных (база дадзеных RefSeq у BiG-FAM)29 і эксперыментальна праверанай (MIBIG 2.0)30 BGC.Для кожнага з 17 689 рэпрэзентатыўных BGC мы абралі найменшую косінусную адлегласць да адпаведнай базы дадзеных.Гэтыя мінімальныя адлегласці затым усярэднія (сярэдняе) у адпаведнасці з GCF або GCC, у залежнасці ад выпадку.GCF лічыцца новым, калі адлегласць да базы даных больш за 0,2, што адпавядае ідэальнаму падзелу паміж (сярэднім) GCF і эталонам.Для GCC мы выбіраем 0,4, што ўдвая перавышае парогавае значэнне, вызначанае GCF, каб зафіксаваць доўгатэрміновыя адносіны са спасылкамі.
Метагеномная колькасць BGC ацэньвалася як сярэдняя колькасць яго біясінтэтычных генаў (як вызначана анты-SMASH), даступных з профіляў геннага ўзроўню.Затым метагеномная колькасць кожнага GCF або GCC была разлічана як сума рэпрэзентатыўных BGC (з 17 689).Гэтыя карты колькасці былі пасля нармалізаваны для клеткавага складу з выкарыстаннем колькасці mOTU на ўзор, што таксама ўлічвала намаганні па секвенировании (пашыраныя дадзеныя, мал. 1d).Распаўсюджанасць GCF або GCC разлічвалася як працэнт узораў з колькасцю > 0.
Эўклідава адлегласць паміж узорамі была разлічана з нармалізаванага профілю GCF.Памер гэтых адлегласцей быў паменшаны з дапамогай UMAP77, а атрыманыя ўбудовы выкарыстоўваліся для некантраляванай кластарызацыі на аснове шчыльнасці з дапамогай HDBSCAN78.Аптымальная мінімальная колькасць балаў для кластара (і, такім чынам, колькасць кластараў), які выкарыстоўваецца HDBSCAN, вызначаецца максімізацыяй сукупнай верагоднасці членства ў кластары.Ідэнтыфікаваныя кластары (і выпадковая збалансаваная падвыбарка гэтых кластараў для ўліку зрушэння ў перастаўным шматмерным дысперсійным аналізе (PERMANOVA)) былі правераны на значнасць у параўнанні з нерэдукаванымі эўклідавымі адлегласцямі з дапамогай PERMANOVA.Сярэдні памер геному ўзораў быў разлічаны на аснове адноснай колькасці mOTU і меркаванага памеру геному членаў геномаў.У прыватнасці, сярэдні памер геному кожнага mOTU быў ацэнены як сярэдняе значэнне памераў геному яго членаў з папраўкай на паўнату (пасля фільтрацыі) (напрыклад, 75% поўнага геному даўжынёй 3 Мб мае адкарэктаваны памер 4 Мб).для сярэдніх геномаў з цэласнасцю ≥70%.Затым сярэдні памер геному для кожнага ўзору быў разлічаны як сума памераў геному mOTU, узважаных па адноснай колькасці.
Адфільтраваны набор закадзіраваных геномам BGC у OMD паказаны ў бактэрыяльных і археальных дрэвах GTDB (у рамках ≥5 кб, за выключэннем REF і SAG MarDB, якія не знойдзены ў 1038 метагеномах, гл. вышэй) і іх прагназаваных катэгорыях прадуктаў на аснове філагенетычных становішча геному (гл. вышэй).Спачатку мы скарацілі дадзеныя па відах, выкарыстоўваючы ў якасці рэпрэзентатыўнага геном з найбольшай колькасцю BGC у гэтым выглядзе.Для візуалізацыі прадстаўнікі былі падзелены на групы дрэў, і зноў для кожнай клетачнай клады ў якасці прадстаўніка быў абраны геном, які змяшчае найбольшую колькасць BGC.Віды, узбагачаныя BGC (прынамсі, адзін геном з >15 BGC), былі дадаткова прааналізаваны шляхам разліку індэкса разнастайнасці Шэнана для тыпаў прадуктаў, закадзіраваных у гэтых BGC.Калі ўсе прадказаныя тыпы прадуктаў аднолькавыя, хімічныя гібрыды і іншыя складаныя BGC (як прадказвае анты-SMAH) лічацца належаць да аднаго тыпу прадукту, незалежна ад іх парадку ў кластары (напрыклад, зліццё бялку-бактэрыяцыну і бактэрыяцыну-пратэапратэіна цела).гібрыд).
Астатняя ДНК (паводле ацэнак, 6 нг) з узору Malaspina MP1648, адпавядае біялагічнаму ўзору SAMN05421555 і супадае з наборам метагеномнага счытвання Illumina SRR3962772 для кароткага счытвання, апрацаванага ў адпаведнасці з пратаколам секвенирования PacBio з звышнізкім уводам для выкарыстання камплекта PacBio ампліфікацыі ўзору gDNA SMRTbell камплект (100-980-000) і набор для падрыхтоўкі шаблонаў SMRTbell Express 2.0 (100-938-900).Карацей кажучы, астатнюю ДНК разрэзалі, адрамантавалі і ачысцілі (шарыкі ProNex) з дапамогай Covaris (g-TUBE, 52104).Затым вычышчаная ДНК падвяргаецца бібліятэчнай падрыхтоўцы, ампліфікацыі, ачыстцы (шарыкі ProNex) і выбару памеру (>6 кб, Blue Pippin) перад апошнім этапам ачысткі (шарыкі ProNex) і секвенаваннем на платформе Sequel II.
Рэканструкцыя першых двух прыбл.Для MAG Eremiobacterota мы ідэнтыфікавалі шэсць дадатковых ANI >99% (яны ўключаны ў малюнак 3), якія першапачаткова былі адфільтраваны на аснове балаў забруджвання (пазней ідэнтыфікаваныя як дублікацыі генаў, гл. ніжэй).Мы таксама знайшлі паднос з надпісам «Ca».Eremiobacterota» з розных даследаванняў23 і выкарыстаў іх разам з васьмю MAG з нашага даследавання ў якасці эталона для метагеномных чытанняў з 633 узбагачаных (>0,8 мкм) эукарыятычных узораў з выкарыстаннем BWA (v.0.7.17) Ref -r1188, - сцяг) для паніжанай дыскрэтызацыі. картаграфаванне (5 мільёнаў чытанняў).На аснове ўзбагачэння спецыфічных карт (адфільтраваных па 95% ідэнтычнасці выраўноўвання і 80% ахопу чытання), 10 метагеномаў (чаканы ахоп ≥5×) былі выбраны для зборкі і дадатковыя 49 метагеномаў (чаканы ахоп ≥1×) для карэляцыі кантэнту.Выкарыстоўваючы тыя ж параметры, што і вышэй, гэтыя ўзоры былі аб'яднаны і дададзены 10 дадатковых "Ca".MAG Eremiobacterota быў адноўлены.Гэтыя 16 MAG (не лічачы двух, якія ўжо знаходзяцца ў базе дадзеных) даводзяць агульную колькасць геномаў у пашыраным OMD да 34 815.MAG прысвойваюцца таксанамічныя рангі на аснове іх геномнага падабенства і пазіцыі ў GTDB.18 MAG былі дэрэплікаваны з дапамогай dRep на 5 відаў (унутрывідавы ANI >99%) і 3 роды (унутрыродавы ANI ад 85% да 94%) у межах адной сям'і79.Прадстаўнікі відаў былі адабраны ўручную на аснове цэласнасці, забруджвання і N50.Прапанаваная наменклатура прадстаўлена ў Дадатковай інфармацыі.
Ацаніце цэласнасць і забруджанасць 'Ca.MAG Eremiobacterota, мы ацанілі наяўнасць uscMG, а таксама аднакопійных генных набораў маркераў, якія выкарыстоўваюцца CheckM і Anvi'o.Ідэнтыфікацыя 2 дублікатаў з 40 uscMG была пацверджана філагенетычнай рэканструкцыяй (гл. ніжэй), каб выключыць любое патэнцыйнае заражэнне (гэта адпавядае 5% на аснове гэтых 40 маркерных генаў).Дадатковае даследаванне пяці рэпрэзентатыўных MAG 'Ca.Нізкі ўзровень забруджванняў у гэтых рэканструяваных геномах быў пацверджаны для відаў Eremiobacterota з выкарыстаннем інтэрактыўнага інтэрфейсу Anvi'o, заснаванага на карэляцыі колькасці і складу паслядоўнасці (дадатковая інфармацыя)59.
Для філагенамічных аналізу мы абралі пяць рэпрэзентатыўных MAG "Ca".Eudormicrobiaceae», усе віды «Ca.Геном Eremiobacterota і членаў іншых тыпаў (у тым ліку UBP13, Armatimonadota, Patescibacteria, Dormibacterota, Chloroflexota, Cyanobacteria, Actinobacteria і Planctomycetota) даступны ў GTDB (r89)13.Усе гэтыя геномы былі анатаваны, як апісана раней для экстракцыі гена маркера адной копіі і анатацыі BGC.Геномы GTDB былі захаваны ў адпаведнасці з вышэйзгаданымі крытэрамі цэласнасці і забруджвання.Філагенетычны аналіз праводзіўся з выкарыстаннем працоўнага працэсу Anvi'o Phylogenetics59.Дрэва было пабудавана з дапамогай IQTREE (v.2.0.3) (параметры па змаўчанні і -bb 1000)80 на аснове выраўноўвання 39 тандэмных рыбасомных бялкоў, ідэнтыфікаваных Anvi'o (MUSCLE, v.3.8.1551)81.Яго пасады былі скарочаныя.каб ахапіць як мінімум 50% геному82, а Planctomycecota выкарыстоўвалася ў якасці старонняй групы на аснове тапалогіі дрэва GTDB.Адно дрэва з 40 uscMG было пабудавана з выкарыстаннем тых жа інструментаў і параметраў.
Мы выкарыстоўвалі Traitar (v.1.1.2) з параметрамі па змаўчанні (фенатып, ад нуклеатыдаў)83 для прагназавання агульных мікробных прыкмет.Мы даследавалі патэнцыйны драпежны лад жыцця на аснове раней распрацаванага драпежнага індэксу84, які залежыць ад утрымання гена, які кадуе бялок, у геноме.У прыватнасці, мы выкарыстоўваем DIAMOND для параўнання бялкоў у геноме з базай дадзеных OrthoMCL (v.4)85, выкарыстоўваючы параметры –more-sensive –id 25 –query-cover 70 –subject-cover 70 –top 20 І падлічыць гены, якія адпавядаюць гены-маркеры драпежнікаў і недрапежнікаў.Індэкс - розніца паміж колькасцю драпежных і недрапежных метак.У якасці дадатковага кантролю мы таксама прааналізавалі геном «Ca».Фактар ​​Entotheonella TSY118 заснаваны на яго сувязі з Ca.Eudoremicrobium (вялікі памер геному і біясінтэтычны патэнцыял).Затым мы праверылі патэнцыйныя сувязі паміж генамі-маркерамі драпежнікаў і недрапежнікаў і біясінтэтычны патэнцыял Ca.Eudormicrobiaceae” і выявіў, што не больш за адзін ген (з любога тыпу гена-маркера, г.зн. гена драпежніка/недрапежніка) перакрываецца з BGC, што сведчыць аб тым, што BGC не бянтэжыць сігналы драпежніцтва.Дадатковая геномная анатацыя зашыфраваных рэпліконаў была выканана з дапамогай TXSSCAN (v.1.0.2) для спецыяльнага вывучэння сістэмы сакрэцыі, пілі і жгуцікаў86.
Пяць рэпрэзентатыўных 'Ca' былі нанесены на карту шляхам адлюстравання 623 метатранскрыптомаў з пракарыётычных і эўкарыётычных фракцый узбагачэння акіянаў Тары22,40,87 (з выкарыстаннем BWA, v.0.7.17-r1188, -a flag).Геном Eudormicrobiaceae.Файлы BAM былі апрацаваны з дапамогай FeatureCounts (v.2.0.1)88 пасля 80% ахопу чытання і 95% фільтрацыі ідэнтычнасці (з параметрамі featureCounts –primary -O –fraction -t CDS,tRNA -F GTF -g ID -p) колькасць уставак на ген.Створаныя карты былі нармалізаваны па даўжыні гена і колькасці гена-маркера mOTU (нармаваны па даўжыні сярэдні лік устаўленняў для генаў з лікам уставак >0) і лагарыфікаваны ў 22,74, каб атрымаць адносную экспрэсію на клетку кожнага ўзроўню гена, што таксама тлумачыць зменлівасць ад узору да ўзору падчас секвенирования.Такія суадносіны дазваляюць праводзіць параўнальны аналіз, змякчаючы праблемы складу пры выкарыстанні даных адноснай колькасці.Для далейшага аналізу былі разгледжаны толькі ўзоры з больш чым 5 з 10 генаў-маркераў mOTU, каб можна было выявіць досыць вялікую частку геному.
Нармалізаваны профіль транскрыптому 'Ca.E. taraoceanii быў падвергнуты памяншэнню памернасці з дапамогай UMAP, а атрыманае прадстаўленне было выкарыстана для некантралюемай кластарызацыі з дапамогай HDBSCAN (гл. вышэй) для вызначэння стану экспрэсіі.PERMANOVA правярае значнасць адрозненняў паміж выяўленымі кластарамі ў зыходнай (не паменшанай) прасторы адлегласці.Дыферэнцыяльная экспрэсія паміж гэтымі ўмовамі была праверана ў геноме (гл. вышэй), і 201 шлях KEGG быў ідэнтыфікаваны ў 6 функцыянальных групах, а менавіта: BGC, гены сістэмы сакрэцыі і жгуцікаў з TXSSCAN, ферменты дэградацыі (пратэазы і пептыдазы), драпежныя і не- драпежныя гены.драпежныя індэксныя маркеры.Для кожнага ўзору мы разлічылі сярэднюю нармалізаваную экспрэсію для кожнага класа (звярніце ўвагу, што сама экспрэсія BGC разлічваецца як сярэдняя экспрэсія біясінтэтычных генаў для гэтага BGC) і праверылі значнасць у розных штатах (тэст Краскала-Уоліса з папраўкай на FDR).
Сінтэтычныя гены былі набыты ў GenScript, а праймеры для ПЦР - у Microsynth.Для ампліфікацыі ДНК выкарыстоўвалася палімераза Phusion ад Thermo Fisher Scientific.Для ачысткі ДНК выкарыстоўваліся плазміды NucleoSpin, гель NucleoSpin і набор для ачысткі ПЦР ад Macherey-Nagel.Рэстрыкцыйныя ферменты і ДНК-лігаза Т4 былі набыты ў New England Biolabs.Хімічныя рэчывы, акрамя ізапрапіл-β-d-1-тиогалактопиранозида (IPTG) (Biosynth) і 1,4-дитиотреитола (DTT, AppliChem), былі набыты ў Sigma-Aldrich і выкарыстоўваліся без дадатковай ачысткі.Антыбіётыкі хлорамфеникол (Cm), спектиномицина дигидрохлорид (Sm), ампіцылін (Amp), гентаміцін (Gt) і карбенициллин (Cbn) былі набыты ў AppliChem.Кампаненты асяроддзя Bacto Tryptone і Bacto Yeast Extract былі набыты ў BD Biosciences.Трыпсінаў для секвенирования быў набыты ў Promega.
Паслядоўнасці генаў былі выняты з прадказанага анты-SMASH BGC 75.1.E. malaspinii (Дадатковая інфармацыя).
Гены embA (локус, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_5), embM (локус, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_4) і embAM (уключаючы міжгенныя вобласці) секвенировали як сінтэтычныя канструкцыі ў pUC57(AmpR) з аптымізацыяй кодонаў і без іх для выражэння ў Э калі.Ген embA быў субкланаваны ў першы сайт множнага кланавання (MCS1) pACYCDuet-1(CmR) і pCDFDuet-1(SmR) з сайтамі расшчаплення BamHI і HindIII.Гены embM і embMopt (аптымізаваныя для кадонаў) былі субкланаваны ў MCS1 pCDFDuet-1(SmR) з дапамогай BamHI і HindIII і змешчаны ў другі сайт множнага кланавання pCDFDuet-1(SmR) і pRSFDuet-1(KanR) (MCS2) з дапамогай NdeI/ChoI.Касета embAM была субклонирована ў pCDFDuet1(SmR) з сайтамі расшчаплення BamHI і HindIII.Ген orf3/embI (локус, MALA_SAMN05422137_METAG-scaffold_127-gene_3) быў сканструяваны метадам ПЦР з пашырэннем перакрыцця з выкарыстаннем праймераў EmbI_OE_F_NdeI і EmbI_OE_R_XhoI, пераваранага NdeI/XhoI і лігаванага ў pCDFDuet-1-EmbM (MCS1) з выкарыстаннем таго ж рэ стрыкцыйныя ферменты (Дадатковы стол).6).Расшчапленне ферментам рэстрыкцыі і перавязку праводзілі ў адпаведнасці з пратаколам вытворцы (New England Biolabs).