Хімічны кампанент спіральнай трубы з нержавеючай сталі 310 10*1 мм, N-канцавыя дамены спідроіну ўтвараюць гідрагелі на аснове амілаідных фібрыл і забяспечваюць платформу для імабілізацыі бялку.

Дзякуй за наведванне Nature.com.Вы выкарыстоўваеце версію браўзера з абмежаванай падтрымкай CSS.Для найлепшага вопыту мы рэкамендуем вам выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer).Акрамя таго, каб забяспечыць пастаянную падтрымку, мы паказваем сайт без стыляў і JavaScript.
Паўзункі, якія паказваюць тры артыкулы на слайдзе.Для перамяшчэння па слайдах выкарыстоўвайце кнопкі "Назад" і "Далей" або кнопкі кантролера слайдаў у канцы для перамяшчэння па кожным слайдзе.

Спецыфікацыя

310 пастаўшчыкоў спіральных труб з нержавеючай сталі 10*1 мм

Хімічны склад

Механічныя ўласцівасці

Рэкамбінантныя вавёркі шоўку павука (бялкі шоўку павука) маюць шмат патэнцыйных ужыванняў у распрацоўцы новых біяматэрыялаў, але іх мультымадальны і схільны да агрэгацыі характар ​​робіць іх цяжкімі для атрымання і простымі ў выкарыстанні.Тут мы паведамляем, што рэкамбінантныя мініяцюрныя вавёркі спидроина і, што важна, сам N-канцавы дамен (NT) хутка ўтвараюць самастойныя і празрыстыя гідрагелі пры 37 °C.злітыя вавёркі, якія складаюцца з NT і зялёнага флуоресцентного бялку або пурынавых нуклеозидфосфорилазы, утвараюць цалкам функцыянальныя злітыя вавёркі.Гідрагелі.Нашы вынікі паказваюць, што рэкамбінантныя NT і злітыя вавёркі забяспечваюць высокі выхад экспрэсіі і надзяляюць гідрагелі такімі прывабнымі ўласцівасцямі, як празрыстасць, гелеўтварэнне без сшывання і прамая імабілізацыя актыўных бялкоў пры высокай шчыльнасці.
У павукоў ёсць да сямі розных набораў шаўковых залоз, кожная з якіх вырабляе пэўны тып шоўку.Усе сем відаў шоўку складаюцца з бялкоў шоўку павука (спідроінаў) даўжынёй каля 6000 астаткаў і ўтрымліваюць вялікую цэнтральную вобласць паўтораў, акружаную сферычнымі N- і C-канцавымі даменамі (NT і CT)1,2.Найбольш шырока вывучаны тып шоўку, першасная ампула, вырабляецца першаснай залозай ампулы.У гэтай залозе аднаслой эпітэліяльных клетак сінтэзуе вавёркі спидроины і вылучае іх у прасвет залозы, дзе яны прысутнічаюць у растваральнай форме (допінг) у надзвычай высокіх канцэнтрацыях (30-50% мас./аб.)3,4.Арганізацыя і канфармацыя асноўных ампулярных бялкоў спідроіну ў жалезе абмяркоўвалася, але большасць эксперыментальных дадзеных паказвае на наяўнасць у цэлым спіральнай і/або выпадковай спіральнай канфармацыі і міцэлярных або пласціністых структур 5,6,7,8,9,10.У той час як паўтаральныя дамены рэгулююць механічныя ўласцівасці шаўковых валокнаў, утвараючы нанакрышталі β-лістоў і аморфныя структуры 11,12,13,14,15, канчатковыя дамены рэгулююць шаўковыя валокны ў адказ на змяненне ўмоў уздоўж шаўковай залозы 16,17,18.Кантралюючы адукацыю шоўку, 19. Тэрмінальныя дамены эвалюцыйна захоўваюцца, і іх функцыя можа быць агульнай для ўсіх бялкоў спидроина 2,20,21.Падчас праходжання праз залозу рн спидроина зніжаецца прыкладна з 7,6 да <5,716 і павялічваецца пры зруху і расцяжэнні, апасродкаваных рухам па паступова звужаецца пратоцы.У растворы CT з'яўляецца α-спіральным канстытутыўным паралельным дымерам 17, але ў адказ на нізкі pH і сілы зруху CT разгортваецца і пераключае β-слоі 16, 17, магчыма запускаючы β-слоі ў паўтаральных абласцях Convert 16. NT з'яўляюцца манамернымі пад ўмовы, якія адлюстроўваюць ўмовы ў прасвеце залозы і апасродкуюць растваральнасць спидроина, але пры паніжаным рн, протонирование шэрагу бакавых ланцугоў карбонавых кіслот прыводзіць да димеризации NT з рКа прыкладна 6,5, тым самым стабілізуючы NT і фіксуючы спидроин ў вялікіх колькасці.сеткі16,18.Такім чынам, NT гуляе ключавую ролю ў фарміраванні нітак, ператвараючыся з манамера ў пакрыцці ў дымер у валакне 23, 24, 25.NT застаецца вельмі растваральным і спіральным пры ўсіх умовах, вывучаных да цяперашняга часу16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, што натхніла на яго распрацоўку ў якасці меткі, якая павялічвае растваральнасць, для вытворчасці гетэралагічных бялкоў.
Рэкамбінантны міні-пратэін шоўку павука, які складаецца з адной NT, адной вобласці з кароткім паўторам, адной CT і тэга His6 (His-NT2RepCT) для ачысткі, гэтак жа растваральны ў водным буферы, як і натыўны бялок шоўку павука, і імітуе важныя характарыстыкі шаўковага павука. .ахоп 25.31.His-NT2RepCT можа быць прадзены ў бесперапынныя валакна з дапамогай біяміметычнай машыны, у якой растваральнае пакрыццё pH 8 экструдуецца ў вадзяную лазню pH 525,32,33,34,35.Ферментацыя ў біярэактары E. coli, якая экспрэсіруе His-NT2RepCT, і наступная апрацоўка прывялі да выхаду >14 г/л пасля ачысткі.Высокі выхад, высокая растваральнасць і адэкватная рэакцыя His-NT2RepCT на кіслотныя ўмовы прыпісваюцца NT23, 25, 34.
Тут мы паведамляем аб хуткім адукацыі празрыстых гідрагеляў з рэкамбінантных бялкоў спидроина, у тым ліку толькі NT, шляхам інкубацыі раствора бялку пры 37 °C.Выкарыстоўваючы флуарэсцэнцыю тыафлавіну Т (ThT), інфрачырвоную спектраскапію з пераўтварэннем Фур'е (FTIR), спектраскапію ядзернага магнітнага рэзанансу (ЯМР) і трансмісійную электронную мікраскапію (TEM), мы выявілі, што вавёркі NT і мікрапавука падвяргаюцца структурнай трансфармацыі ў β-лісты і амілаідападобныя фібрылы калі ўтвараюцца гелі.Акрамя таго, злітыя вавёркі NT і зялёны флуарэсцэнтны бялок (GFP) або пурын нуклеазідфасфарылаза (PNP) утвараюць гідрагелі з цалкам функцыянальнымі фрагментамі зліцця.Высокая прапускная здольнасць экспрэсіі ў гетэралагічных гаспадарах у спалучэнні з хуткім утварэннем гідрагеляў у фізіялагічных умовах адкрывае магчымасць эканамічна эфектыўнай вытворчасці гідрагеляў з інжынернымі функцыямі.
У адрозненне ад большасці зарэгістраваных рэкамбінантных бялкоў спидроина36, His-NT2RepCT стабільны ў буферы Tris-HCl пры pH 8 і можа канцэнтравацца да 500 мг/мл без выпадзення асадка25.Такім чынам, мы былі здзіўлены, выявіўшы, што гэты бялок хутка ўтварае аптычна празрыстыя самастойныя гідрагелі пры інкубацыі пры 37 ° C (мал. 1b-d).Далейшыя даследаванні паказалі, што гелеобразование His-NT2RepCT адбывалася ў шырокім дыяпазоне канцэнтрацый бялку (10-300 мг/мл) і што гэтая канцэнтрацыя была ў зваротнай карэляцыі з часам гелеутворення (мал. 1с і дадатковы малюнак 1).Каб высветліць, якія часткі His-NT2RepCT апасродкуюць адукацыю гідрагеля, мы даследавалі кожны дамен паасобку і ў розных камбінацыях з дапамогай інверсійнага аналізу колбы (малюнак 1a,b).Усе правераныя фракцыі рэкамбінантныя спидроина ўтвараюць гелі (пры канцэнтрацыі бялку 300 мг/мл) менш чым за 1 гадзіну, за выключэннем абложанага 2Rep (мал. 1б).Гэта дазваляе выказаць здагадку, што NT і CT паасобку, у спалучэнні або ў спалучэнні з паўторамі, могуць гелеобразовать пры 37°C і што тэг His6 не ўплывае на гэты працэс у значнай ступені.Улічваючы распаўсюджанае ўяўленне аб тым, што NT з'яўляецца вельмі растваральным і стабільным бялком, і што папярэднія справаздачы аб рэкамбінантных гідрагелях спидроина прыпісвалі эфект гелеутворення канфармацыйным зменам у паўторных абласцях і/або CT, сама NT магла б.Адкрыццё гелеобразования было нечаканым.Дадатковая табліца 1) 37, 38, 39. Цікава, што NT ужо гелеобразуется на працягу 10 хвілін пры канцэнтрацыі ≥ 300 мг/мл (мал. 1c).Эксперыменты па інверсіі флакона з рознымі канцэнтрацыямі NT паказалі, што пры >50 мг/мл раствор NT гелеобразуется хутчэй, чым His-NT2RepCT пры адпаведнай канцэнтрацыі (маса/аб'ём, малюнак 1с).
Схематычнае прадстаўленне розных канструкцый спидроина, вывучаных у гэтай працы.b Час гелеўтварэння пры 37 °C для розных рэкамбінантных бялкоў спидроина (300 мг/мл), правераны шляхам перагортвання флакона.КТ-гель неадкладна без інкубацыі (<300 мг/мл), 2 паўторных асадка (300 мг/мл, маштаб 5 мм).c Час гелеўтварэння His-NT2RepCT і NT пры паказаных канцэнтрацыях бялку пры 37°C.d Фатаграфіі гідрагеляў His-NT2RepCT і NT з павуком і літарай «NT», надрукаванай знізу адпаведна (абодва 200 мг/мл, шкала 5 мм).
Гідрагелі, адукаваныя рознымі рэкамбінантнымі вавёркамі спидроином, маюць некалькі розныя колеры, і назіранне няўзброеным вокам паказвае розную ступень празрыстасці (мал. 1b).Гелі NT выключна празрыстыя, у той час як іншыя гелі становяцца непразрыстымі.Гелі His-NT2RepCT і NT, адлітыя ў цыліндрычныя трубкі, можна было выдаліць з формы некранутымі (мал. 1d).
Каб праверыць, ці з'яўляюцца гелевыя пакрыцця з натуральнага шоўку павука ва ўмовах, якія, як цяпер выяўлена, выклікаюць гелеўтварэнне рэкамбінантных бялкоў спідроіну, былі сабраны пакрыцця з вялікай залозы ампулы шведскага павука-мостніка (Larinioides sclopetarius).Пакрыцці захоўвалі ў 20 мм буферы Tris-HCl пры 50 мг/мл (у разліку на вымераную сухую масу), але гелеўтварэння не назіралася на працягу 21 дня інкубацыі пры 37 °C (дадатковы малюнак 2а).
Для колькаснай ацэнкі гэтых геляў можна выкарыстоўваць рэалагічныя вымярэнні для вывучэння працэсу гелеутворення і вызначэння агульных механічных уласцівасцей.У прыватнасці, маніторынг модуля захоўвання (пругкасці) пры павышаных тэмпературах можа даць інфармацыю аб тэмпературы жэліравання, а таксама аб вязкапругкіх уласцівасцях пакрыцця.Эксперыменты павышэння тэмпературы (з выкарыстаннем 1°C/хв пры 25-45°C, заснаваныя на папярэдніх даследаваннях з выкарыстаннем асноўных раствораў натуральнага шоўку)40,41 паказалі, што модулі захоўвання раствораў His-NT2RepCT і NT павялічваюцца з павышэннем тэмпературы.быў павялічаны (мал. 2 і дадатковы малюнак 3).Характэрна, што модуль NT пачаў расці пры больш нізкай тэмпературы ў параўнанні з His-NT2RepCT, што адпавядае больш хуткаму гелеўтварэнню, якое назіралася, калі NT непасрэдна інкубавалі з His-NT2RepCT пры 37°C (малюнак 1).Пасля наступнага падзення тэмпературы модуль захоўвання не вярнуўся да больш нізкіх значэнняў і заставаўся вышэй за модуль страт (гл. Дадатковы малюнак 3), што паказвае на тэрмічнаму незваротнае стабільнае гелеўтварэнне.Пасля гелеутворення канчатковы модуль пругкасці вагаўся ад 15 да 330 кПа для гідрагеляў His-NT2RepCT пры канцэнтрацыі 100–500 мг/мл, а канчатковы модуль пругкасці для гідрагеляў NT (100–500 мг/мл) вагаўся ад 2 да 1400. кПа (мал. 2 і поўныя даныя нахілу) гл. дадатковы малюнак 3).
a Змена тэмпературы падчас вымярэнняў His-NT2RepCT (300 мг/мл) і b NT (300 мг/мл) пры ўстрэсванні.Стрэлкі паказваюць тэндэнцыю тэмпературы, а больш светлае зацяненне дадзеных модуля захоўвання адлюстроўвае тэставанне пры больш нізкіх значэннях крутоўнага моманту для прыбора, чым указана вытворцам, што з'яўляецца прычынай павышанага шуму.c Назапашванне His-NT2RepCT і NT на канцавым модулі пасля павышэння тэмпературы (100, 300 і 500 мг/мл).Усе паказанні модуля здымаюцца з частатой 0,1 Гц.
У якасці патэнцыйнага метаду даследавання канфармацыйных змен, звязаных з гелеўтварэннем, мы запісалі спектры FTIR His-NT2RepCT і NT да і пасля гелеўтварэння пры 37°C (малюнак 3a,b).Як і чакалася, спектры раствораў His-NT2RepCT і NT адпавядалі вавёркам, якія дэманструюць другасную структуру α-спіралі/выпадковай шпулькі з ярка выяўленай паласой пры 1645 см-1.Для абодвух гідрагеляў гелеўтварэнне прывяло да адукацыі двух рукавоў у сярэдняй паласе I каля 1617 см-1 і 1695 см-1 (мал. 3a, b), што паказвае на адукацыю антыпаралельных β-ліставых структур.Гэтыя змены таксама можна добра ўбачыць у адпаведных другіх вытворных і рознічных спектрах гелеутворення (дадатковы мал. 4b).Дзве паласы β-слоя NT былі больш выяўленымі, чым у His-NT2RepCT, што паказвае на тое, што агульнае ўтрыманне палос β-слая ў гідрагелі NT было вышэй, чым у гідрагелі NT2RepCT.
a спектры паглынання FTIR His-NT2RepCT і b NT (абодва 500 мг/мл) да (раствор) і пасля (гель) інкубацыі пры 37°C.c TEM выявы ресуспендированных 50 мг/мл геляў NT2RepCT і d NT.Шкала 200 нм.e Дыяметры валокнаў гідрагеляў His-NT2RepCT і NT.n = 100 вымераных фібрыл, р <0,0001.Палоскі памылак паказваюць стандартнае адхіленне.Цэнтр палос памылак - гэта сярэдняе значэнне.Для статыстычнага аналізу выкарыстоўваўся няпарны t-крытэрый (двухбаковы).f Флуарэсцэнцыя ThT розных рэкамбінантныя бялкоў спидроина (100 мг/мл) пры 37 °C без устрэсвання.g Эксперыменты па інакуляцыі NT (100 мг/мл) з 100 мг/мл геля NT з 0%, 5%, 10% і 20% насення.
Аналіз геля з дапамогай трансмісійнай электроннай мікраскапіі (ПЭМ) паказаў, што гідрагель складаецца з амілаідападобных фібрыл (мал. 3c, 3d).Фібрылы, утвораныя NT, былі падоўжанымі (5-12 нм у дыяметры) і неразгалінаванымі, у той час як фібрылы His-NT2RepCT былі карацей у даўжыню і значна шырэй у дыяметры (7-16 нм) (мал. 3e).Гэтыя вынікі дазволілі нам прасачыць за кінэтыкай фіброзу з дапамогай аналізу на тиофлавин Т (ThT).Для ўсіх рэкамбінантных бялкоў спидроина флуоресцентный сігнал павялічваўся, калі ўзоры інкубавалі пры 37 °C (мал. 3f, дадатковы малюнак 5а).У адпаведнасці з гэтым высновай, мікраскапічнае даследаванне NT і His-NT2RepCT ва ўмовах гелеутворення выявіла раўнамернае павелічэнне флуарэсцэнцыі ThT без прыкметнага лакальнага назапашвання ThT-станоўчых агрэгатаў (дадатковы малюнак 5b,c).Адукацыя ThT-станоўчых фібрыл не суправаджалася павелічэннем мутнасці NT і His-NTCT (дадатковы малюнак 5d), што азначае, што сетка фібрыл у гелі можа ўтварыцца без шкоды для празрыстасці геля.Пасеў шляхам дадання невялікай колькасці папярэдне сфармаваных фібрыл можа значна паскорыць адукацыю фібрыл некаторых амілаідаў42,43,44, але даданне 5%, 10% або 20% (мас./мас.) NT да раствора гідракаагулянтаў NT.эфект пасеву (мал. 3g).Магчыма, гэта звязана з тым, што фібрылы ў гідрагель адносна фіксаваныя і не могуць выкарыстоўвацца ў якасці затравак.
Нечаканыя паводзіны рэкамбінантных бялкоў спидроина пры высокіх тэмпературах падштурхнулі да далейшых даследаванняў спектраскапіі ядзернага магнітнага рэзанансу (ЯМР) для выяўлення канфармацыйных змен, звязаных з адукацыяй геля.ЯМР-спектры раствораў His-NT2RepCT, запісаныя з цягам часу пры 37°C, паказалі, што CT усё яшчэ часткова згорнуты, у той час як сігналы NT і 2Rep зніклі (мал. 4а), што сведчыць аб тым, што ў асноўным NT і 2Rep часткова кантралююць адукацыю His- Гідрагель NT2RepCT.Сігнал КТ таксама быў аслаблены да 20% ад першапачатковай інтэнсіўнасці, што сведчыць аб тым, што КТ таксама ў асноўным фіксаваны і ўключаны ў структуру гідрагеля.Для меншай часткі КТ, якая такая ж рухомая, як і ў папярэдне інкубаванай пробе і, такім чынам, назіраецца з дапамогай ЯМР раствора, у спектрах адсутнічаюць сігналы для першых 10 структураваных астаткаў, магчыма, з-за цяжкай імабілізацыі прымацаванай часткі His-NT2Rep.Спектры ЯМР -стану гідрагеляў -NT2RepCT выявілі пераважную прысутнасць α-спіраляў і β-слаёў і, у меншай ступені, выпадковую канфармацыю шпулькі (мал. 4b).Аналіз хімічнага зруху рэшткаў метионина, якія прысутнічаюць толькі ў NT, паказаў, што гэты дамен быў ператвораны ў структуру β-ліста.Залежныя ад часу спектры NT у растворы паказалі раўнамернае памяншэнне інтэнсіўнасці сігналу (мал. 4c), а цвёрдацельны ЯМР гідрагеляў NT паказаў, што большасць рэшткаў NT былі ператвораны ў β-ліставыя структуры (мал. 4d).Канфармацыя 2Rep не можа быць вызначана асобна з-за яго тэндэнцыі да агрэгацыі.Аднак спектры ЯМР у цвёрдым стане гідрагеляў NTCT і His-NT2RepCT выглядалі вельмі падобна (мал. 4b; дадатковы малюнак 6b), што сведчыць аб тым, што 2Rep унёс невялікі ўклад у структурную частку гідрагеля His-NT2RepCT.Для гідрагеляў CT было ўстаноўлена, што існуюць α-спіралі, β-лісты і выпадковыя спіральныя другасныя структуры (дадатковы малюнак 6d).Гэта сведчыць аб тым, што некаторыя часткі CT застаюцца α-спіралі, а іншыя становяцца β-лістамі.Такім чынам, вынікі ЯМР-спектраскапіі сведчаць аб тым, што NT важны для адукацыі гідрагеля, а таксама ператвараецца ў канфармацыю β-ліста пры зліцці з 2Rep і CT.У адпаведнасці з гэтым мы нядаўна выявілі, што амилоидные прасторавыя маланкі, верагодна, утвараюцца ва ўсіх пяці спіралях NT-дамена, і алгарытм Вальца прадказаў амилоидогенную вобласць у спіралі 1 (мал. 4e).
2D-спектры раствора 15N-HSQC 10 мг/мл His-NT2RepCT да (сіні) і праз 19 гадзін пасля інкубацыі (чырвоны) пры 37°C.Асобныя папярочныя пікі ў чырвоным спектры і F24, G136, polyA ў сінім спектры пазначаюцца адналітарнымі сімваламі амінакіслот і нумарамі рэшткаў.На ўстаўках паказана залежнасць інтэнсіўнасці сігналу ад часу для выбраных рэшткаў з даменаў NT, 2Rep і CT.b Цвёрдацельныя радыёчастотныя (RFDR) спектры гідрагеляў His-NT2RepCT.Карэляцыі рэшткаў Cα/Cβ, якія назіраюцца ў спектрах RFDR, былі вызначаны шляхам параўнання з мадэльнымі хімічнымі зрухамі пептыдаў і значэннямі, атрыманымі са статыстычных дадзеных82,83 і іх другасных структур.SSB – паваротная бакавая паласа.c Аднамерныя спектры раствора 15N-HSQC 10 мг/мл NT падчас інкубацыі пры 37 °C на працягу 36 гадзін.Урэзка паказвае залежнасць аб'ёмнай інтэнсіўнасці ад часу.d Спектры RFDR у цвёрдым стане гідрагеляў NT.Пазначаны карэляцыі астаткаў Cα/Cβ і іх другасных структур, якія назіраюцца ў спектрах RFDR.e На аснове профілю схільнасці да фібрыляцыю NT45.79 з базы дадзеных Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Энергія Разеты акна прасторавага зруху маланкі гексапептыда паказана ў ккал/моль.Чырвоныя палоскі абазначаюць гексапептыды з высокай схільнасцю да фіброзу (энергія Разетты ніжэй за -23 ккал/моль; ніжэй пункцірнай лініі).Зялёныя палоскі паказваюць фрагменты з энергіяй Разетты вышэй парогавага значэння і, такім чынам, з меншай верагоднасцю ўтвараюць стэрычныя маланкі.Фрагменты, якія змяшчаюць пралін, былі выключаны з аналізу (без слупкоў).Квадраты паказваюць вобласці амілаідозам, прадказаныя алгарытмам Вальса81 (https://waltz.switchlab.org).Паслядоўнасць амінакіслотных астаткаў NT знаходзіцца ўверсе, а тыпы астаткаў, знойдзеных у β-другаснай структуры (вызначанай ЯМР-спектраскапіяй цвёрдага цела), паказаны чырвоным.Палажэнні пяці α-спіраляў NT пазначаны як (H1-H5)28.
Пры pH <6,5 HT дымерызуецца, будучы ўстойлівым да дэнатурацыі, выкліканай цяплом або мачавінай18.Каб высветліць, як дымерызацыя і стабільнасць NT уплываюць на гелеўтварэнне, растворы, якія змяшчаюць 100 мг/мл NT, кантралявалі пры рн 8, 7 і 6 з дапамогай тэсту на пераварот флакона.Узоры NT, інкубаваныя пры рн 8 і 7, гелеобразуются праз 30 хвілін пры 37 °C, але гель рн 8 заставаўся празрыстым, а гель рн 7 паказаў бачны асадак (мал. 5а).Наадварот, раствор, які змяшчае HT пры рн 6, не ўтварае геля, і праз 20 хвілін пры 37 ° C можна было ўбачыць вялікі асадак.Гэта сведчыць аб тым, што самі дымеры і/або іх больш высокая стабільнасць у параўнанні з мономерами прадухіляюць гелеобразование.Утварэнне асадка для NT пры pH 7 і 6 не чакалася, паколькі паведамлялася, што NT раствараецца пры 200 мг/мл27, лёгка згортваецца пасля цеплавой дэнатурацыі, а таксама захоўвае α-спіраль пры меншых значэннях pH 18. Верагодным тлумачэннем гэтых разыходжанняў з'яўляецца тое, што эксперыменты, пра якія паведамлялася раней, праводзіліся пры пакаёвай тэмпературы або ніжэй, або пры адносна нізкіх канцэнтрацыях бялку 16,18,19.
Тэст інверсіі флакона NT (100 мг/мл) пры pH 8, 7, 6 і 154 мм NaCl (pH 8) пасля інкубацыі пры 37°C.b Спектры NT CD з і без 154 мм NaF і 154 мм NaCl адпаведна.Малярная эліптычнасць пры 222 нм пераўтворыцца ў долю натуральных зморшчын.c Інверсійны аналіз NT (100 мг/мл) NT* (37 °C і 60 °C), NTA72R (37 °C) і His-NT-L6 (37 °C і 60 °C).d CD-спектры NT-мутантаў NT*, NTA72R і His-NT-L6.Малярная эліптычнасць пры 222 нм пераўтворыцца ў долю натуральных зморшчын.e Тэст інверсіі NTFlSp, NTMiSp і адноўленага NTMiSp (100 мг/мл).Шкала 5 мм.f CD-спектры NT, NTFlSp, NTMiSp і адноўленага NTMiSp.Малярная эліптычнасць пры 222 нм пераўтворыцца ў долю натуральных зморшчын.Поўныя спектры NT пры 25 °C і 95 °C паказаны на дадатковым малюнку 8.
Фізіялагічная канцэнтрацыя солі вызначае электрастатычныя ўзаемадзеянні паміж субадзінак NT і дымерызацыю пераносу NT да больш нізкага pH18.Мы выявілі, што прысутнасць 154 мМ NaCl і NaF сапраўды інгібіруе гелеўтварэнне адпаведна (мал. 5a, b; дадатковы малюнак 2b) і што гэтыя солі павялічваюць тэрмічную стабільнасць манамераў NT (мал. 5b, дадатковы малюнак 8) .Гэта таксама сведчыць аб тым, што павышэнне стабільнасці, а не дымерызацыя, прадухіляе адукацыю геля.
Для далейшага вывучэння ролі дымерызацыі і стабільнасці бялку ў гелеобразовании мы выкарысталі два мутанта, NT* і NTA72R, якія таксама застаюцца мономерными пры нізкім pH28,30.NT* - гэта мутант падвойнага звароту зарада, у якім уяўнае дыпалярнае размеркаванне зарада манамера згладжана, што прадухіляе дымерызацыю і рэзка павялічвае стабільнасць манамера.NTA72R - гэта зараджаны дыполь, але Arg-замешчаная Ala знаходзіцца на мяжы дымера, таму мутацыі перашкаджаюць узаемадзеянням субадзінак, неабходным для дымерызацыі.Пры інкубацыі пры 37 ° C, NT * не ўтвараюць гідрагель, у той час як NTA72R ўтворыцца непразрысты гель на працягу 15 хвілін (мал. 5c).Паколькі і NT*, і NTA72R не могуць дымерызавацца, але адрозніваюцца стабільнасцю манамера (мал. 5d), гэтыя вынікі пераканаўча сведчаць аб тым, што высокая тэрмадынамічная стабільнасць прадухіляе гелеутварэнне NT.Гэта таксама пацвярджаецца тым фактам, што HT * ўтварае гель, калі ён нестабільны пры высокай тэмпературы (пасля 8 хвілін пры 60 ° C; мал. 5c).Раней было паказана, што высокае ўтрыманне метионина ў NT разрэджвае яго натуральнае згортванне і што шэсць заменнікаў Met на Leu (тут іх называюць His-NT-L6) моцна стабілізуюць манамер NT46.Зыходзячы з здагадкі, што структурная гнуткасць неабходная для фарміравання геля NT, мы выявілі, што стабільны мутант His-NT-L6 не гелеобразуется пры 37 °C (мал. 5c, d).Аднак His-NT-L6 таксама ўтвараў гель пры інкубацыі пры 60°С на працягу 60 хвілін (мал. 5в).
Здольнасць NT трансфармавацца ў β-ліставыя структуры і ўтвараць гідрагелі, відаць, прымяняецца да некаторых, але не да ўсіх даменаў NT спідроіну.NT з розных тыпаў шоўку і відаў павукоў, Trichonephila clavipes (NTFlSp), утварылі гелі, нягледзячы на ​​адносна нізкае ўтрыманне метионина і высокую тэрмічную стабільнасць (мал. 5e, f і дадатковая табліца 2).Наадварот, NT з малога ампулярного бялку спидроина з Araneus ventricosus (NTMiSp) з нізкай тэрмічнай стабільнасцю і высокім утрыманнем метионина не ўтварае гідрагелі (дадатковая табліца 2 і мал. 5e, f).Апошняе можа быць звязана з наяўнасцю ўнутрымалекулярных дисульфидных сувязяў29,47.Паслядоўна, калі дисульфидные сувязі NTMiSp былі паменшаныя, ён утварыў гідрагель пасля інкубацыі пры 37 ° C на працягу 10 хвілін (мал. 5e).У заключэнне варта адзначыць, што структурная гнуткасць з'яўляецца важным, але не адзіным крытэрыем адукацыі геля з НТ.Іншым фактарам, які можа мець значэнне, з'яўляецца схільнасць да адукацыі амілаідных фібрыл, і аналіз з дапамогай базы дадзеных маланкі і алгарытму Вальца сапраўды паказаў карэляцыю паміж здольнасцю ўтвараць гелі і наяўнасцю амілаідагенных абласцей, а таксама памерам прадказаных абласцей. утвараць стэрыльныя маланкі.Была карэляцыя (дадатковая табліца 2 і дадатковы малюнак 9).
Здольнасць NT утвараць фібрылы і гелі ў спрыяльных умовах прывяла нас да гіпотэзы, што зліццё NT з іншымі бялковымі фрагментамі ўсё яшчэ можа ўтвараць гелі з поўнай функцыяй партнёраў па зліцці.Каб праверыць гэта, мы ўвялі зялёны флуарэсцэнтны бялок (GFP) і пурын нуклеазідфасфарылазу (PNP) на С-канцы NT адпаведна.Атрыманыя злітыя вавёркі экспрэсіруюцца ў кішачнай палачцы з вельмі высокім канчатковым выхадам (150 мг/л і 256 мг/л культуры ва ўстрэсваемай колбе для His-NT-GFP і His-NT-PNP адпаведна), што адпавядае таму, што было паказана для іншых бялкоў, злітых з NT Ref.30. Злітыя вавёркі His-NT-GFP (300 мг/мл) і His-NT-PNP (100 мг/мл) утварылі гелі праз 2 гадзіны 6,5 гадзіны пры 37°C, і, што важна, фракцыя GFP засталася нязменнай.назіраецца пасля гелеутворення, прычым >70% ад пачатковай інтэнсіўнасці флуарэсцэнцыі застаецца пасля гелеутворення (мал. 6а).Каб вымераць актыўнасць PNP у растворах і гелях his-NT-PNP, нам прыйшлося разбавіць зліты бялок NT, таму што ферментатыўная актыўнасць чыстага прэпарата была за межамі дыяпазону выяўлення аналізу пры гелеобразующих канцэнтрацыях.Гель, утвораны з сумессю, якая змяшчае 0,01 мг/мл His-NT-PNP і 100 мг/мл NT, захаваў 65% першапачатковай ферментатыўнай актыўнасці преинкубированных узораў (мал. 6b).Гель заставаўся некранутым падчас вымярэння (дадатковы мал. 10).
a Адносная інтэнсіўнасць флуарэсцэнцыі да і пасля гелеобразования His-NT-GFP (300 мг/мл) і перавернутага флакона, які змяшчае гідрагель His-NT-GFP (300 мг/мл) у бачным і УФ-святле.Кропкі паказваюць асобныя вымярэнні (n = 3), паласы памылак паказваюць стандартнае адхіленне.Сярэдняе значэнне паказваецца ў цэнтры палос памылак.b Актыўнасць PNP была атрымана з дапамогай флуорометрического аналізу з выкарыстаннем раствораў і геляў, якія складаюцца з NT (100 мг/мл) і сумесі, якая змяшчае 0,01 мг/мл his-NT-PNP і 100 мг/мл новых тайваньскіх даляраў.На ўстаўцы паказаны перавернуты флакон з гідрагелем, які змяшчае His-NT-PNP (шкала 5 мм).
Тут мы паведамляем аб адукацыі гідрагеляў з NT і іншых рэкамбінантных бялкоў спидроина шляхам інкубацыі раствора бялку пры 37 ° C (мал. 1).Мы паказваем, што гелеобразование звязана з ператварэннем α-спіраляў у β-слаі і адукацыяй амилоидоподобных фібрыл (мал. 3 і 4).Гэтая знаходка з'яўляецца дзіўнай, паколькі NT - гэта згорнутыя шарападобныя пучкі з пяці спіраляў, вядомыя сваёй надзвычай высокай растваральнасцю і высокай стабільнасцю пры канцэнтрацыях >200 мг/мл пры 4°C на працягу некалькіх дзён27.Акрамя таго, NT лёгка згортваюцца пасля цеплавой дэнатурацыі пры нізкіх канцэнтрацыях бялку ў мкМ.Згодна з нашымі вынікамі, адукацыя фібрыл патрабуе спалучэння канцэнтрацыі бялку >10 мг/мл і злёгку падвышанай тэмпературы (мал. 1).Гэта супадае з ідэяй, што амілаідныя фібрылы могуць утварацца з шарападобных згорнутых бялкоў, якія знаходзяцца ў часткова разгорнутым стане з-за цеплавых флуктуацый у фізіялагічных умовах 48 .Прыклады бялкоў, якія падвяргаюцца гэтаму пераўтварэнню, ўключаюць інсулін49,50, β2-мікраглабулін, транстырэцін і лізацым51,52,53.Нягледзячы на ​​тое, што NT з'яўляецца α-спіраль у сваім натуральным стане, прыкладна 65% поліпептыднага ланцуга сумяшчальна з адукацыяй стэрычнай маланкі (мал. 4e) 45 .Паколькі манамер дынамічна рухомы46, ён можа выкрываць гэтыя патэнцыйныя амілаідагенныя вобласці пры ўмерана павышаных тэмпературах, а пры высокіх канцэнтрацыях агульнага бялку можа дасягаць крытычнай канцэнтрацыі для адукацыі амілаідных фібрыл54.Пасля гэтых разваг мы выявілі адмоўную карэляцыю паміж канцэнтрацыяй спидроина і часам гелеобразования (мал. 1c), і калі манамерная канфармацыя NT стабілізуецца альбо мутацыямі (NT*, His-NT-L6), альбо даданнем солі, гэта можа прадухіліць адукацыя гідрагеляў (мал. 5).
У большасці выпадкаў амілаідныя фібрылы знікаюць з раствора ў выглядзе асадка, але пры пэўных умовах яны могуць утвараць гідрагель55,56,57.Фібрылы, якія ўтвараюць гідрагель, звычайна маюць высокае суадносіны бакоў і ўтвараюць стабільныя трохмерныя сеткі праз малекулярнае заблытанне,55,58 у адпаведнасці з нашымі вынікамі.Для фарміравання гідрагеля in vitro вавёркі часта поўнасцю або часткова разгортваюцца, напрыклад, уздзеяннем арганічных растваральнікаў, высокай тэмпературы (70-90°C) і/або нізкага pH (1,5-3,0)59,60,61,62.Гідрагелі спідроіну, апісаныя тут, не патрабуюць жорсткай апрацоўкі, а таксама не патрабуюць сшываючых агентаў для стабілізацыі гідрагеляў.
Раней паведамлялася, што паўторы спідроіну і КТ, якія, здаецца, падвяргаюцца пераключэнню β-лістоў падчас прадзення шоўку, утвараюць гідрагелі.У параўнанні з нашымі высновамі, час інкубацыі і/або тэмпература інкубацыі былі значна даўжэйшымі або вышэйшымі адпаведна, а атрыманыя гідрагелі часта былі непразрыстымі (малюнак 7 і дадатковая табліца 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. У дадатак да хуткага гелеўтварэння гідрагелі NT >300 мг/мл (30%) пераўзышлі ўсе іншыя апісаныя гідрагелі рэкамбінантнага бялку шоўку павука, а таксама натуральныя гідрагелі, такія як жэлацін, альгінат (2%), агар (0,5 %) ) і калаген.(0,6%) (малюнак 7 і дадатковыя табліцы 1 і 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Час геля і модуль пругкасці гідрагеляў у гэтым даследаванні параўноўвалі з іншымі гідрагелямі на аснове спидроина і выбранымі прыроднымі гідрагелямі.Спасылкі прыведзены разам з апісаннем умоў гелеутворення.APS Персульфат амонія, пакаёвая тэмпература.Дадзеныя 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Здаецца, павукі распрацавалі спосабы прадухілення жэліравання спідроіну падчас захоўвання.Нягледзячы на ​​высокую канцэнтрацыю бялку ў шаўковай залозе, вялікая паўтаральная вобласць, звязаная з канцавым даменам, азначае, што ўяўная канцэнтрацыя NT і CT у залозе адпавядае прыблізна 10-20 мг/мл на мяжы гэтага даследавання.неабходны для назірання in vitro адукацыі гідрагеля.Акрамя таго, падобныя канцэнтрацыі соляў 16 стабілізавалі NT, як у шаўковых залозах (мал. 5b).Канфармацыя NT была вывучана ў цытазолі кішачнай палачкі і аказалася больш шчыльнай, чым пры даследаванні in vitro, што дадаткова паказвае на тое, што соль або іншыя фактары перашкаджаюць яе агрэгацыі in vivo.Аднак здольнасць NT ператварацца ў фібрылы β-ліста можа быць важнай для фарміравання нітак і павінна быць даследавана ў будучых даследаваннях.
У дадатак да новых аспектаў адукацыі NT-амілаідападобных фібрыл і гідрагеляў, назіраных у гэтым даследаванні, мы таксама паказваем, што гэтая з'ява можа мець біятэхналагічнае і біямедыцынскае прымяненне (мал. 8).У якасці доказу канцэпцыі мы аб'ядналі NT з GFP або PNP і паказалі, што зліты бялок таксама ўтварае гідрагелі пры інкубацыі пры 37 °C і што фракцыі GFP і PNP у значнай ступені захоўваюць сваю актыўнасць пасля гелеўтварэння (малюнак 6).Нуклеазідфасфарылазы з'яўляюцца важнымі каталізатарамі сінтэзу нуклеазідных аналагаў75, што робіць наша адкрыццё актуальным для біяфармацэўтычнай прамысловасці.Канцэпцыя экспрэсіі злітых бялкоў, якія ўтвараюць празрыстыя гідрагелі ў спрыяльных умовах, дазваляе ствараць функцыяналізаваныя гідрагелі са спрыяльнымі ўласцівасцямі для шырокага спектру прымянення, такіх як імабілізацыя ферментаў, кантраляванае вызваленне лекаў і тканкавая інжынерыя.Акрамя таго, NT і NT* з'яўляюцца эфектыўнымі маркерамі экспрэсіі30, што азначае, што NT і яго варыянты можна выкарыстоўваць для высокапрадукцыйнай вытворчасці растваральных злітых бялкоў і наступнага стварэння імабілізаваных бялкоў-мішэняў у 3D-гідрагелях.
NT растваральны, α-спіральны і стабільны пры нізкіх канцэнтрацыях (мкМ) і 37°C.Пры той жа тэмпературы, але пры нарастаючых канцэнтрацыях (>10 мг / мл) NT ўтварае гелі, якія складаюцца з амилоидоподобных фібрыл.Злітыя вавёркі NT таксама ўтвараюць фібрылярныя гелі з цалкам функцыянальнымі фрагментамі зліцця, што дазваляе імабілізаваць розныя вавёркі ў трохмерных гідрагелях з дапамогай NT.Унізе: NT (PDB: 4FBS) і ілюстрацыі валаконных сетак і звязаных з імі бялковых структур (мяркуюцца і не намаляваныя ў маштабе, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Канструкцыі (гл. Дадатковую табліцу 4 для поўнага спісу, уключаючы паслядоўнасці амінакіслот) былі кланаваны ў плазміду pT7 і трансфармаваны ў E. coli BL21 (DE3).Кішачную палачку, якая змяшчае сканструяваныя плазміды, засявалі ў булён Лурыя з даданнем канаміцыну (70 мг/л) і вырошчвалі на працягу ночы пры 30°C і 250 абаротах у хвіліну.Затым культуру засявалі 1/100 у сераду LB, якая змяшчае канаміцын, і культывавалі пры 30°C і 110 абаротаў у хвіліну, пакуль OD600 не дасягнула 0,8.Для даследаванняў ЯМР бактэрыі вырошчвалі ў мінімальнай асяроддзі М9, якая змяшчае 2 г D-глюкозы 13C (Aldrich) і 1 г хларыду амонія 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) для маркіроўкі бялку ізатопамі.Панізіце тэмпературу да 20 градусаў Цэльсія і індукуйце экспрэсію бялку з дапамогай 0,15 мМ изопропилтиогалактопиранозида (канчатковая канцэнтрацыя).Пасля экспрэсіі бялку на працягу ночы, клеткі збіралі пры 7278 × g, 4 ° C на працягу 20 хвілін.Асадак клетак ресуспендировали ў 20 мМ трис-HCl, pH 8, і замарожвалі да далейшага выкарыстання.Размарожаныя клеткі лізіравалі з дапамогай разбуральніка клетак (машыны серыі TS, Constant Systems Limited, Англія) пры 30 кПа.Затым лизаты центрифугировали пры 25000 g на працягу 30 хвілін пры 4 ° С.Для NTMiSp асадак затым ресуспендировали ў 2 М мачавіны, 20 мМ Трыс-HCl, pH 8 і апрацоўвалі ультрагукам на працягу 2 хвілін (2 с укл./выкл., 65%), затым зноў цэнтрыфугавалі пры 25 000 xg, 4°C на працягу 30 хв.Супернатант загружалі ў калонку Ni-NTA, прамывалі 20 ммоль Трыс-HCl, 2 ммоль імідазолу, рн 8, і, нарэшце, бялок элюіравалі 20 ммоль трыс-HCl, 200 ммоль імідазолу, рн 8. Каб стварыць NT2RepCT і NTCT, пераварванне трамбіну ўводзіць месца (ThrCleav) паміж His і NT.Месцы расшчаплення трамбіна таксама прысутнічаюць у His-NT-ThrCleav-2Rep (вырабляе 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (вырабляе NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (вырабляе CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (вырабляе NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (выпрацоўвае NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (вырабляе NTF1Sp) і His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (выпрацоўвае NTMiSp).Канструкцыі расшчаплялі трамбінам (1:1000) і дыялізавалі на працягу ночы пры 4°C з 20 мМ Трис-HCl, рн 8, выкарыстоўваючы дыялізную мембрану Spectra/Por з парогам малекулярнай масы 6-8 кДа.Пасля дыялізу раствор загружаюць у калонку Ni-NTA і збіраюць сцёкі, якія змяшчаюць цікавы бялок.Канцэнтрацыі бялку вызначалі шляхам вымярэння паглынання УФ-выпраменьвання пры 280 нм з выкарыстаннем каэфіцыента экстинкции кожнага бялку, за выключэннем NTF1Sp, у якім выкарыстоўваўся аналіз Брэдфарда ў адпаведнасці з пратаколам вытворцы.Чысціню вызначалі з дапамогай электрафарэзу ў поліакрыламідным гелі (4-20%) SDS і афарбоўвання Кумасі бліскучым сінім.Вавёркі канцэнтравалі з выкарыстаннем цэнтрыфужных фільтраў (VivaSpin 20, GE Healthcare) пры 4000 х г з адсечкай малекулярнай масы 10 кДа за 20-хвілінныя цыклы.
Размарозьце раствор бялку і асцярожна адкапайце 150 мкл у флакон з празрыстай перагародкай аб'ёмам 1 мл (8 х 40 мм Thermo Scientific).Прабіркі былі зачынены вечкамі і зачынены парафільмам, каб прадухіліць выпарэнне.Узоры (n = 3) інкубавалі пры 37°C або 60°C і перыядычна перагортвалі для назірання гелеутворення.Узоры, якія не сталі гелем, інкубавалі як мінімум адзін тыдзень.Паменшыце дысульфідныя сувязі NTMiSp з дапамогай 10 мМ DTT на 10 мкМ бялку.Каб прааналізаваць гелеўтварэнне натуральных пакрыццяў з шоўку павука, павука-шведскага моста разрэзалі, дзве асноўныя ампуліраваныя залозы змясцілі ў 200 мкл 20 мМ трыс-HCl буфера рн 8 і разрэзалі, каб пакрыццё аддзялілася ад залоз..Змесціва залоз раствараюць у буферы, 50 мкл для вызначэння сухой масы (шляхам інкубацыі адкрытых флаконаў пры 60 °C да пастаяннай масы) і 150 мкл для гелеобразования пры 37 °C.
Вымяральная геаметрыя/інструмент выраблены з нержавеючай сталі з выкарыстаннем паралельнай пласціны з верхнім дыяметрам 20 мм і зазорам 0,5 мм.Нагрэйце ўзор ад 25 °C да 45 °C і назад да 25 °C з хуткасцю 1 °C у хвіліну, выкарыстоўваючы ніжнюю пласціну Пельцье з нержавеючай сталі.Вібрацыйныя вымярэнні праводзіліся пры частаце 0,1 Гц і ў лінейнай вязкапругкай вобласці матэрыялу пры дэфармацыі 5% і 0,5% для ўзораў 100 мг/мл і 300-500 мг/мл адпаведна.Каб прадухіліць выпарэнне, выкарыстоўвайце спецыяльную камеру вільготнасці.Дадзеныя аналізаваліся з дапамогай Prism 9.
Для збору інфрачырвоных (ВК) спектраў пры пакаёвай тэмпературы ад 800 да 3900 см–1.Прылада ATR, а таксама шлях святла праз спектрометр прадзімаецца сухім адфільтраваным паветрам да і падчас эксперыменту.Растворы (500 мг/мл для мінімізацыі пікаў паглынання вады ў спектрах) наносілі піпеткай на крышталі, а перад вымярэннем фармавалі гелі (500 мг/мл), а потым пераносілі ў крышталі (n = 3).Было запісана 1000 сканаванняў з дазволам 2 см-1 і нулявым працоўным цыклам 2. Другая вытворная была разлічана з дапамогай OPUS (Bruker) з выкарыстаннем дыяпазону згладжвання ў дзевяць пунктаў.Спектры былі нармалізаваны да той жа вобласці інтэгравання паміж 1720 і 1580 см-1 з дапамогай F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software".У спектраскапіі ATR-IR глыбіня пранікнення інфрачырвонага прамяня ва ўзор залежыць ад хвалевага ліку, што прыводзіць да больш моцнага паглынання пры меншых хвалевых ліках, чым пры больш высокіх.Гэтыя эфекты не былі скарэкціраваны для спектраў, паказаных на мал.3, таму што яны вельмі малыя (дадатковы малюнак 4).Скарэктаваныя спектры для гэтай фігуры былі разлічаны з дапамогай праграмнага забеспячэння Bruker OPUS.
У прынцыпе, поўная колькасная ацэнка канфармацый бялку магчымая пасля надзейнай дэканвалюцыі кампанентаў у межах піка аміду I.Аднак на практыцы ўзнікаюць некаторыя перашкоды.Шум у спектры можа з'явіцца ў выглядзе (ілжывых) пікаў падчас дэканвалюцыі.Акрамя таго, пік з-за выгібу вады супадае з становішчам піка аміду I і можа мець падобную велічыню для ўзораў, якія змяшчаюць вялікую колькасць вады, такіх як даследаваны тут водны гель.Такім чынам, мы не спрабавалі цалкам раскласці пік аміду I, і нашы назіранні варта разглядаць толькі ў падтрымку іншых метадаў, такіх як спектраскапія ЯМР.
Растворы 50 мг/мл NT і His-NT2RepCT жэліруюць на працягу ночы пры 37°C.Затым гідрагель разбаўлялі 20 мМ Tris-HCl (pH 8) да канцэнтрацыі 12,5 мг/мл, добра боўталі і піпеткай разбівалі гель.Затым гідрагель разбаўлялі ў 10 разоў 20 мМ Tris-HCl (pH 8), 5 мкл ўзору наносілі на медную сетку, пакрытую формаварам, і лішкі ўзору выдалялі промокательной паперай.Узоры двойчы прамывалі 5 мкл вады MilliQ і афарбоўвалі 1% уранілафарміятам на працягу 5 хвілін.Выдаліце ​​лішкі плямы ўбіраючай паперай, затым высушыце сетку на паветры.Візуалізацыя выконвалася на гэтых сетках з дапамогай FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN, які працуе пры напрузе 100 кВ.Выявы былі запісаны пры павелічэнні х 26 500 і х 43 000 з дапамогай камеры Veleta 2k × 2k CCD (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Мюнстэр, Германія).Для кожнага ўзору (n = 1) было запісана 10-15 малюнкаў.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) выкарыстоўваўся для аналізу малюнкаў і вымярэння дыяметраў валокнаў (n = 100, розныя валакна).Прызма 9 выкарыстоўвалася для выканання няпарных t-тэстаў (двухбаковага).Сярэднія фібрылы His-NT2RepCT і NT складалі 11,43 (SD 2,035) і 7,67 (SD 1,389) нм адпаведна.Даверны інтэрвал (95%) складае ад -4,246 да -3,275.ступені свабоды = 198, р <0,0001.
80 мкл вадкіх узораў, якія змяшчаюць 10 мкМ тыафлавіну Т (ThT), вымяралі ў трох паўторах (n = 3) у статычных умовах з выкарыстаннем 96-лункавых пласцін Corning з чорным дном і празрыстым дном (Corning Glass 3881, ЗША).Адрозненні флуарэсцэнцыі былі запісаныя з выкарыстаннем фільтра ўзбуджэння 440 нм і эмісійнага фільтра 480 нм (FLUOStar Galaxy ад BMG Labtech, Офенбург, Германія).Сігнал ThT не быў ні насычаным, ні патушаным, паколькі праводзіліся эксперыменты з рознымі канцэнтрацыямі ThT без змены інтэнсіўнасці сігналу.Запішыце паглынанне пры 360 нм для вымярэння дымкі.Для эксперыментаў з пасевам гелі 100 мг/мл утваралі пры 37°C, ресуспендировали і выкарыстоўвалі для пасева пры малярных суадносінах 5%, 10% і 20%.Дадзеныя аналізаваліся з дапамогай Prism 9.
Размарозіце запасы His-NT2RepCT і NT >100 мг/мл на лёдзе і адфільтруйце праз фільтр 0,22 мкм.Канцэнтрацыі былі разлічаны шляхам вымярэння паглынання пры 280 нм з дапамогай Nanodrop.У лунках 96-лункавага чорнага незвязваючага пласціны (Corning) з празрыстым дном узоры разбаўлялі да 20 мг/мл у 20 мМ Tris-HCl рн 8 і змешвалі з 5 мкМ ThT (канчатковая канцэнтрацыя), агульная канцэнтрацыя ўзору Аб'ём 50 мкл.Узоры здымалі кожныя 10 хвілін пры 37 °C на мікраскопе CellObserver (Zeiss) з каналам праходжання святла і наборамі фільтраў узбуджэння і выпраменьвання FITC для візуалізацыі ThT.Для здымкі выкарыстоўваецца аб'ектыў 20x/0,4.Для аналізу малюнкаў выкарыстоўваліся Zen Blue (Zeiss) і ImageJ (https://imagej.nih.gov/).Гелі таксама рыхтавалі з раствораў NT і His-NT2RepCT у канцэнтрацыі 50 мг/мл, якія змяшчаюць 20 мМ Tris pH 8 і 5 мкМ ThT, і інкубавалі пры 37°C на працягу 90 хвілін.Кавалачкі геля пераносілі ў новую лунку, якая змяшчае 20 мМ Трыс, pH 8 і 5 мкМ ThT у неабавязковай чорнай 96-лункавай пласціне з празрыстым дном.Атрымлівайце выявы зялёнай флуарэсцэнцыі і яркага поля пры павелічэнні 20x/0,4.ImageJ быў выкарыстаны для аналізу выявы.
Спектры ЯМР раствора былі атрыманы пры 310 К на спектрометры Bruker Avance Neo 600 МГц, абсталяваным QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).Узоры ЯМР, якія змяшчаюць 10 мг/мл гамагеннага бялку, пазначанага 13C, 15N, растворанага ў 20 мм Tris-HCl (pH 8), 0,02% (мас./аб.) NaN3, 5% DO (аб./аб.), (n = 1) .Хімічныя зрухі NT2RepCT пры pH 6,7 выкарыстоўваліся для прызначэння піку 23 у 2D-спектры 15N-HSQC.
Спектры ЯМР цвёрдага рэчыва пад магічным вуглом кручэння (MAS) гідрагеляў, пазначаных 13C, 15N, былі запісаны на спектрометры Bruker Avance III HD пры 800 МГц, абсталяваным бесэлектронным зондам 3,2 мм 13C/15N{1H}.Тэмпература ўзору кантралявалася з дапамогай газавага патоку з пераменнай тэмпературай пры 277 К. Спектры двухмернага дыпольнага вярчальнага рэзанансу (DARR) 76 і радыёчастотнага перападключэння (RFDR) 77 былі атрыманы на частотах MAS 12,5 кГц і 20 кГц адпаведна.Перакрыжаваная палярызацыя (CP) ад 1H да 13C выконвалася з выкарыстаннем лінейнага нарастання ад 60,0 да 48,0 кГц пры 1H, 61,3/71,6 кГц пры 13C (пры 12,5/20 кГц MAS) і часу кантакту 0,5–1 мс.Падчас збору даных выкарыстоўвалася развязка Spinal6478 на 73,5 кГц.Час атрымання склаў 10 мілісекунд, а затрымка цыкла - 2,5 секунды.Адназвязаныя карэляцыі Cα/Cβ, якія назіраюцца ў спектрах RFDR, былі прысвоены на аснове характэрных хімічных зрухаў астаткавага тыпу і шматзвязаных карэляцый у спектрах DARR.
База дадзеных Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) была выкарыстана для ацэнкі тэндэнцый флаттэра і энергіі Rosetta для NT, NTFlSp і NTMiSp.База дадзеных Zipper вылічае Rosetta Energy80, якая аб'ядноўвае некалькі функцый свабоднай энергіі для мадэлявання і аналізу структуры бялку.Узровень энергіі -23 ккал/моль або ніжэй паказвае на высокую схільнасць да фібрыляцыі.Меншая энергія азначае большую стабільнасць дзвюх β-ланцугоў у канфармацыі маланкі.Акрамя таго, алгарытм Waltz выкарыстоўваўся для прагназавання амілаідагенных абласцей у NT, NTFlSp і NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Раствор бялку NT змешвалі з буферам 2-(N-морфоліно)этансульфонавай кіслаты (MES) пры рн 5,5 і 6,0, каб знізіць рн да рн 6 і 7 адпаведна.Канчатковая канцэнтрацыя бялку склала 100 мг/мл.
Вымярэння праводзілі на спектрометре J-1500 CD (JASCO, ЗША) з выкарыстаннем кюветы аб'ёмам 300 мкл з аптычным шляхам 0,1 см.Вавёркі разводзяць да 10 мкМ (n = 1) у 20 мМ фасфатнага буфера (рН 8).Каб прааналізаваць стабільнасць бялку ў прысутнасці солі, вавёркі аналізавалі пры той жа канцэнтрацыі (n = 1) у 20 ммоль фасфатнага буфера (pH 8), які змяшчае 154 ммоль NaF або NaCl адпаведна.Тэмпературныя сканы былі запісаныя пры 222 нм ад 25°C да 95°C з хуткасцю нагрэву 1°C/мін.Доля натыўна згорнутых бялкоў разлічвалася па формуле (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Акрамя таго, пяць спектраў былі запісаны для кожнага ўзору ад 260 нм да 190 нм пры 25 ° C і пасля нагрэву да 95 ° C.Пяць спектраў былі асераднёныя, згладжаныя і пераведзены ў малярную эліптычнасць.Дадзеныя аналізаваліся з дапамогай Prism 9.
Інтэнсіўнасць флуарэсцэнцыі His-NT-GFP (300 мг/мл, 80 мкл) вымяралі ў трох паўторах (n = 3) у 96-лункавых пласцінах Corning з чорным празрыстым дном (Corning Glass 3881, ЗША) у статычных умовах.Вымерайце ўзоры пры дапамозе флуарэсцэнтнага счытвальніка пласцін з даўжынёй хвалі ўзбуджэння 395 нм і запішыце выпраменьванне пры 509 нм перад гелеўтварэннем і праз 2 гадзіны пры 37°C.Дадзеныя былі прааналізаваны з дапамогай Prism 9.
Набор для аналізу актыўнасці пурын-нуклеазід-фосфарылазы (флуорометрический метад, Sigma Aldrich) выкарыстоўвалі ў адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы.Каб вымераць актыўнасць у гелях і растворах, якія змяшчаюць His-NT-PNP, змяшайце 10 нг His-NT-PNP са 100 мг/мл NT да агульнага аб'ёму 2 мкл, таму што гель даваў сігнал вышэй інтэрвалу выяўлення набору.Кантролі для геляў і раствораў без His-NT-PNP былі ўключаны.Вымярэнні праводзіліся двойчы (n = 2).Пасля вымярэння актыўнасці рэакцыйную сумесь выдаляюць і гель фатаграфуюць, каб пераканацца, што гель заставаўся цэлым падчас вымярэння.Дадзеныя аналізаваліся з дапамогай Prism 9.
Для атрымання дадатковай інфармацыі аб дызайне даследавання глядзіце анатацыю аб даследаванні Nature, спасылка на якую спасылаецца на гэты артыкул.
На малюнках 1 і 2 прадстаўлены зыходныя даныя.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f і 6, дадатковыя мал.3, дадатковы мал.5а, г, дадатковы мал.6 і дадатковы мал.8. Дадзеныя Дадзеныя гэтага даследавання размешчаны ў базе даных Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Дадзеныя ЯМР, атрыманыя ў гэтым даследаванні, былі размешчаны ў рэпазітары BMRBig пад ідэнтыфікатарам запісу bmrbig36.Структуры GFP і PNP былі ўзятыя з PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. і Johansson, J. Прадзенне штучнага шоўку павука.Нацыянальная хімічная.біялогіі.11, 309–315 (2015).
Babb, PL і інш.Геном Nephila clavipes падкрэслівае разнастайнасць генаў шоўку павука і іх складаную экспрэсію.Нацыянальны Genette.49, 895–903 (2017).