347 12,7*1,24 мм спіральная трубка з нержавеючай сталі, малекулярны механізм сінхроннай электрастатычнай кандэнсацыі і каагрэгацыі α-сінуклеіну і тау

Дзякуй за наведванне Nature.com.Вы выкарыстоўваеце версію браўзера з абмежаванай падтрымкай CSS.Для найлепшага вопыту мы рэкамендуем вам выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer).Акрамя таго, каб забяспечыць пастаянную падтрымку, мы паказваем сайт без стыляў і JavaScript.
Паўзункі, якія паказваюць тры артыкулы на слайдзе.Для перамяшчэння па слайдах выкарыстоўвайце кнопкі "Назад" і "Далей" або кнопкі кантролера слайдаў у канцы для перамяшчэння па кожным слайдзе.

Тэхнічныя характарыстыкі труб з нержавеючай сталі 347

347 12,7*1,24 мм спіральная труба з нержавеючай сталі

Вонкавы дыяметр: 6,00 мм OD да 914,4 мм OD, памеры да 24” NB даступныя са склада, OD Памер сталёвых труб даступныя са склада

SS 347 Дыяпазон таўшчыні труб: 0,3 мм - 50 мм, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S і г.д. (0,5-12 мм) Або нестандартны памер, які будзе адаптаваны па меры неабходнасці

Тып: бясшвовыя трубы SS 347 |Трубы SS 347 ERW |SS 347 Зварныя трубы |Гатовыя трубы SS 347 |Трубы SS 347 CDW, трубы LSAW / зварныя швом / перамаляваныя

Форма: SS 347 круглыя ​​трубы/трубы, SS 347 квадратныя трубы/трубы, SS 347 прамавугольныя трубы/трубы, SS 347 змеевыя трубы, SS 347 «U» формы, SS 347 змеявікі для торта, SS 347 гідраўлічныя трубы

Даўжыня: адна выпадковая, падвойная выпадковая і неабходная даўжыня Канец: гладкі канец, скошаны канец, з пратэктарамі

Канчатковая абарона: пластыкавыя каўпачкі |Знешняя аздабленне: 2B, No.4, No.1, No.8 Люстраная аздабленне для труб з нержавеючай сталі, аздабленне ў адпаведнасці з патрабаваннямі заказчыка

Умовы пастаўкі: адпаленыя і марынаваныя, паліраваныя, яркія адпаленыя, халодная выцяжка

Інспекцыі, пратаколы выпрабаванняў: Сертыфікаты выпрабаванняў млына, EN 10204 3.1, Справаздачы аб хімічных рэчывах, Справаздачы аб механічных характарыстыках, Справаздачы аб выпрабаваннях PMI, Справаздачы аб візуальных аглядах, Справаздачы аб аглядах трэціх асоб, Справаздачы лабараторый, зацверджаных NABL, Справаздача аб разбуральных выпрабаваннях, Справаздачы аб неразбуральных выпрабаваннях

Упакоўка: спакаваныя ў драўляныя скрынкі, поліэтыленавыя пакеты, сталёвыя палоскі ў камплекце, або ў адпаведнасці з запытамі кліентаў

Спецыяльныя прапановы: памеры і тэхнічныя характарыстыкі, акрамя вышэйзгаданых, могуць быць выраблены па запыце

SS 347 Дыяпазон памераў труб: 1/2 цалі NB, OD да 24 цаляў

ASTM A312 347: Бясшвовыя і прамашовныя зварныя аўстенітныя трубы, прызначаныя для працы пры высокіх тэмпературах і агульнай карозіі.Недапушчальны прысадкавы метал пры зварцы.

ASTM A358 347: Электрычная зварная аўстэнітная труба для карозійнай і/або высокай тэмпературы.Звычайна па гэтай спецыфікацыі вырабляюцца толькі трубы дыяметрам да 8 цаляў.Пры зварцы дапускаецца даданне прысадка.

ASTM A790 347: бясшвовыя і прамашовныя зварныя ферытныя/аўстэнітныя (дуплексныя) трубы, прызначаныя для агульнага каразійнага ўздзеяння, з асаблівым акцэнтам на ўстойлівасць да каразійнага расколіны пад напругай.

ASTM A409 347: аўстэнітная лёгкасценная труба вялікага дыяметра з прамым або спіральным швом, зварная электраплаўленнем, памерам ад 14 да 30 цаляў са сценкамі Sch5S і Sch 10S для каразійнай і/або высокай

ASTM A376 347: Бясшвовыя аўстэнітныя трубы для прымянення пры высокіх тэмпературах.

ASTM A813 347: аднашовная, адна- або двухзварная аўстэнітная труба для прымянення пры высокіх тэмпературах і каразіі.

ASTM A814 347: зварная аўстэнітная труба халоднай апрацоўкі для высокай тэмпературы і агульнай карозіі.

Хімічны склад труб з нержавеючай сталі 347H

Механічныя ўласцівасці труб з нержавеючай сталі 347H

Фізічныя ўласцівасці труб з нержавеючай сталі 347H

Эквівалентныя маркі для труб з нержавеючай сталі 347H

Агрэгацыя амілаіда альфа-сінуклеіна (αS) з'яўляецца адметнай рысай хваробы Паркінсана і іншых сінуклеінапатый.Нядаўна таў-бялок, звычайна звязаны з хваробай Альцгеймера, быў звязаны з паталогіяй αS і выяўлена, што ён лакалізуецца ў багатых αS уключэннях, хоць малекулярны механізм каагрэгацыі двух бялкоў застаецца незразумелым.Тут мы паведамляем, што фаза αS падзяляецца на вадкія кандэнсаты праз кандэнсацыю электрастатычнага комплексу з дадатна зараджанымі поліпептыдамі, такімі як тау.У залежнасці ад сродства αS да полікатыёнаў і хуткасці знясілення валентнасці каагуляцыйнай сеткі згусткі падвяргаюцца хуткаму гелеобразованию або зліццю з наступнай павольнай агрэгацыяй амилоида.Аб'яднаўшы набор перадавых біяфізічных метадаў, мы змаглі ахарактарызаваць фазавы падзел вадкасць-вадкасць αS/Tau і вызначыць ключавыя фактары, якія прыводзяць да адукацыі гетэрагенных агрэгатаў, якія змяшчаюць абодва вавёркі ў вадкім бялковым кандэнсаце.
У дадатак да мембранных аддзелаў, прасторавага падзелу ў клетках таксама можна дасягнуць шляхам адукацыі багатых бялком, падобных на вадкасць шчыльных целаў, якія называюцца біямалекулярнымі кандэнсатамі або кроплямі, з дапамогай працэсу, вядомага як падзел фаз вадкасць-вадкасць (LLPS).Гэтыя кроплі ўтвараюцца ў выніку шматвалентных часовых узаемадзеянняў, звычайна паміж вавёркамі або вавёркамі і РНК, і выконваюць розныя функцыі практычна ва ўсіх жывых сістэмах.Вялікая колькасць LLP-здольных бялкоў дэманструе паслядоўнасці нізкай складанасці, якія вельмі бязладныя па сваёй прыродзе і ўтвараюць біямалекулярныя кандэнсаты3,4,5.Шматлікія эксперыментальныя даследаванні выявілі гнуткую, часта неўпарадкаваную і шматвалентную прыроду бялкоў, якія складаюць гэтыя вадкападобныя кандэнсаты, хоць мала вядома пра канкрэтныя малекулярныя дэтэрмінанты, якія кантралююць рост і паспяванне гэтых кандэнсатаў да больш цвёрдападобных стан..
Новыя дадзеныя пацвярджаюць гіпотэзу аб тым, што LLPS, які кіруецца аберрантным бялком, і трансфармацыя кропель у цвёрдыя структуры могуць быць адпаведнымі клеткавымі шляхамі, якія вядуць да адукацыі нерастваральных таксічных агрэгатаў, якія часта з'яўляюцца прыкметамі дэгенератыўных захворванняў.Многія звязаныя з LLPS бялкі з унутраным парушэннем парадку (IDP), часта моцна зараджаныя і гнуткія, даўно звязаны з нейрадэгенерацыяй праз працэс агрэгацыі амілоідаў.У прыватнасці, было паказана, што біямалекулярныя кандэнсаты IDP, такія як FUS7 або TDP-438, або вавёркі з вялікімі даменамі нізкай складанасці, такія як hnRNPA19, ператвараюцца ў гелепадобныя ці нават цвёрдыя формы праз працэс, які называецца псевдоожижением.злучэнне.да пераходу ў цвёрдую фазу (LSPT) у залежнасці ад часу або ў адказ на пэўныя посттрансляцыйныя мадыфікацыі або паталагічна значныя мутацыі1,7.
Іншым IDP, звязаным з LLPS in vivo, з'яўляецца Tau, неўпарадкаваны бялок, звязаны з мікратрубачкамі, агрэгацыя амілаідаў якога была звязана з хваробай Альцгеймера 10, але нядаўна таксама была замяшана ў хваробе Паркінсана (PD) і іншых сінаптычных ядзерных пратэінапатыях 11, 12, 13.Было паказана, што тау самаадвольна адлучаецца ад раствора/цытаплазмы дзякуючы спрыяльным электрастатычным узаемадзеянням14, што прыводзіць да адукацыі кропель, узбагачаных тау, вядомых як электрастатычныя каацэрваты.Было таксама заўважана, што гэты тып неспецыфічнага ўзаемадзеяння з'яўляецца рухаючай сілай многіх біямалекулярных кандэнсатаў у прыродзе15.У выпадку таў-бялку электрастатычная агрэгацыя можа ўтварацца простай агрэгацыяй, пры якой процілегла зараджаныя вобласці бялку запускаюць працэс расшчаплення, або складанай агрэгацыяй праз узаемадзеянне з адмоўна зараджанымі палімерамі, такімі як РНК.
Нядаўна α-сінуклеін (αS), амілаідны IDP, які ўдзельнічае ў PD і іншых нейрадэгенератыўных захворваннях, у сукупнасці вядомых як синуклеинопатии 17, 18, быў прадэманстраваны на клеткавых і жывёл мадэлях 19, 20, сканцэнтраваны ў бялковых кандэнсатах з вадкаснымі паводзінамі.Даследаванні in vitro паказалі, што αS падвяргаецца LLPS шляхам простай агрэгацыі за кошт пераважна гідрафобных узаемадзеянняў, хоць гэты працэс патрабуе выключна высокіх канцэнтрацый бялку і нетыпова доўгага часу інкубацыі19,21.Ці ўтвараюцца кандэнсаты, якія змяшчаюць αS, назіраныя in vivo, у выніку гэтага або іншых працэсаў LLPS, застаецца ключавой нявырашанай праблемай.Аналагічным чынам, хаця агрэгацыя амілаіда αS назіралася ў нейронах пры БП і іншых сінуклеінапатыях, дакладны механізм, з дапамогай якога αS падвяргаецца ўнутрыклеткавай агрэгацыі амілоіду, застаецца незразумелым, паколькі празмерная экспрэсія гэтага бялку, здаецца, не запускае гэты працэс сама па сабе.Часта патрабуецца дадатковае клеткавае пашкоджанне, што сведчыць аб тым, што для рэнуклеацыі ўнутрыклеткавых амілаідных зборак αS неабходныя пэўныя клетачныя месцы або мікраасяроддзі.Адным клеткавым асяроддзем, якое асабліва схільна да агрэгацыі, можа быць унутраная частка бялковых кандэнсатаў 23 .
Цікава, што было ўстаноўлена, што αS і tau лакалізуюцца ў характэрных для хваробы ўключэннях у людзей з хваробай Паркінсана і іншымі сінуклеінапатыямі 24,25, а эксперыменты паказалі сінэргетычную паталагічную сувязь паміж двума вавёркамі 26,27, што сведчыць аб патэнцыйнай сувязі паміж агрэгацыяй αS і тау пры нейрадэгенератыўных захворваннях.хвароба.Было выяўлена, што αS і tau ўзаемадзейнічаюць і спрыяюць агрэгацыі адзін аднаго in vitro і in vivo 28,29, а гетэрагенныя агрэгаты, якія складаюцца з гэтых двух бялкоў, назіраліся ў мозгу пацыентаў з сінуклеінапатыямі 30 .Аднак мала што вядома пра малекулярныя асновы ўзаемадзеяння паміж αS і тау і механізм яго сумеснай агрэгацыі.Паведамляецца, што αS узаемадзейнічае з тау праз электрастатычнае прыцягненне паміж моцна адмоўна зараджанай С-канцавой вобласцю αS і цэнтральнай багатай пралінам вобласцю тау, якая таксама ўзбагачана станоўча зараджанымі астаткамі.
У гэтым даследаванні мы паказваем, што αS сапраўды можа дысацыяваць на кроплі з дапамогай кандэнсацыі электрастатычнага комплексу ў прысутнасці бялку тау, у адрозненне ад яго ўзаемадзеяння з іншымі станоўча зараджанымі поліпептыдамі, такімі як полі-L-лізін (pLK), і ў гэтым працэсе.αS дзейнічае як малекула каркаса для сеткі кропель.Мы выявілі прыкметныя адрозненні ў працэсе паспявання электрастатычных αS коацерватов, якія звязаны з адрозненнямі ў валентнасці і сіле ўзаемадзеяння бялкоў, якія ўдзельнічаюць у коацерватной сеткі.Цікава, што мы назіралі каагрэгацыю αS і тау-амілаідных бялкоў у доўгажывучых вадкіх каацэрватах і выявілі некаторыя ключавыя фактары, якія прыводзяць да каагрэгацыі гэтых двух бялкоў у такіх каацэрватах.Тут мы падрабязна апісваем гэты працэс, які з'яўляецца магчымым малекулярным механізмам, які ляжыць у аснове колокализации двух бялкоў у спецыфічных для хваробы ўключэннях.
αS мае вельмі аніённы С-канцавы хвост пры нейтральным pH (мал. 1а), і мы выказалі здагадку, што ён можа падвяргацца LLPS праз кандэнсацыю электрастатычных комплексаў з поликатионными неўпарадкаванымі малекуламі поліпептыдаў.Мы выкарысталі полі-L-лізін (pLK) са 100 астаткамі ў якасці малекулы зыходнай мадэлі з-за яго станоўча зараджанай і неўпарадкаванай палімернай прыроды пры нейтральным pH 32. Па-першае, мы пацвердзілі, што pLK узаемадзейнічае з Ct-даменам αS з дапамогай спектраскапіі ЯМР раствора (Малюнак 1b) з выкарыстаннем αS, пазначанага 13C/15N, у прысутнасці малярных суадносін αS:pLK, якія павялічваюцца.Узаемадзеянне pLK з Ct-даменам αS выяўляецца ў парушэннях хімічнага зруху і зніжэнні інтэнсіўнасці піка ў гэтай вобласці бялку.Цікава, што калі мы змяшалі αS з pLK пры канцэнтрацыі αS прыбл.5–25 мкМ у прысутнасці поліэтыленгліколя (5–15% ПЭГ-8) (тыповы буфер LLPS: 10 ммоль HEPES рн 7,4, 100 ммоль NaCl, 15% ПЭГ-8) мы неадкладна прайшлі праз шырокае поле ўтварэння бялку. .кроплі назіралі з дапамогай флуарэсцэнтнай (WF) і светлавольнай (BF) мікраскапіі (мал. 1c).Кроплі памерам 1-5 мкм, якія змяшчаюць канцэнтраваны αS (дададзены 1 мкМ αS, пазначаны AlexaFluor488, AF488-αS), іх электрастатычныя ўласцівасці могуць быць атрыманы з іх устойлівасці да 10% 1,6-гександиола (1,6-HD) і яго адчувальнасці да павелічэнне канцэнтрацыі NaCl (мал. 1в).Падобная на вадкасць прырода коацерватов электрастатычнага комплексу αS/pLK дэманструецца іх здольнасцю злівацца за мілісекунды (мал. 1d).Выкарыстоўваючы турбідыметрыю, мы колькасна ацанілі адукацыю кропель у гэтых умовах, пацвердзілі электрастатычную прыроду асноўнага ўзаемадзеяння, звязанага з яго стабільнасцю (мал. 1e), і ацанілі ўплыў розных суадносін палімераў на працэс LLPS (мал. 1f).Хоць утварэнне кропель назіраецца ў шырокім дыяпазоне палімерных суадносін, працэс вельмі спрыяльны, калі pLK перавышае αS.LLP таксама назіраліся з выкарыстаннем хімічна іншага выцясняльніка дэкстран-70 (70 кДа) або з выкарыстаннем розных фарматаў узораў, уключаючы кроплі на прадметных шклах, лункі мікрапланшэтаў з розных матэрыялаў, капіляры Эпендорфа або кварц.
Схематычнае адлюстраванне розных абласцей бялку ў варыянтах WT-αS і ΔCt-αS, якія выкарыстоўваюцца ў гэтым даследаванні.Амфіпатычны N-канцавы дамен, гідрафобная амілаідаўтваральная вобласць (NAC) і адмоўна зараджаны С-канцавы дамен паказаны сінім, аранжавым і чырвоным адпаведна.Паказана карта чыстай платы за астатак (NCPR) WT-αS.b ЯМР-аналіз узаемадзеяння αS/pLK у адсутнасць макрамалекулярных згусткаў.Па меры павелічэння канцэнтрацыі pLK (малярныя суадносіны αS:pLK 1:0,5, 1:1,5 і 1:10 паказаны светла-зялёным, зялёным і цёмна-зялёным адпаведна).c Коацерват αS/pLK (малярныя суадносіны 1:10) пры 25 мкМ (1 мкМ αS, пазначаны AF488 або Atto647N, pLK для візуалізацыі WF) у буферы LLPS (уверсе) або з дадаткам 500 мМ NaCl (унізе злева) або пасля 10 % 1,6-гександиол (1,6-HD; унізе справа).Шкала = 20 мкм.d Рэпрэзентатыўныя мікраскапічныя выявы зліцця BF кропель αS/pLK (малярныя суадносіны 1:10) пры канцэнтрацыі 25 мкМ;стрэлкі паказваюць зліццё асобных кропель (чырвоная і жоўтая стрэлкі) у новую кроплю (аранжавая стрэлка) на працягу 200 мс).Шкала = 20 мкм.e Рассейванне святла (пры 350 нм) Агрэгацыя αS/pLK у буферы LLPS да і пасля дадання 500 мМ NaCl або 10% 1,6-HD пры 25 мкМ αS (N = 3 паўторы ўзору, таксама пазначаны сярэдняе і стандартнае адхіленне).f Выява BF (уверсе) і аналіз рассейвання святла (пры 350 нм, унізе) агрэгацыі αS/pLK пры 25 мкМ αS з павелічэннем малярнага суадносін αS:pLK (N = 3 паўторы ўзору, таксама пазначаны сярэдняе і стандартнае адхіленні).Шкала = 10 мкм.Маштабная паласа на адной выяве паказвае маштаб усіх выяваў на адной панэлі.Неапрацаваныя даныя прадастаўляюцца ў выглядзе файлаў неапрацаваных даных.
Грунтуючыся на нашых назіраннях за кандэнсацыяй электрастатычнага комплексу αS/pLK і папярэдніх назіраннях за αS як малекулай-кліентам кандэнсату tau/РНК праз прамое ўзаемадзеянне з tau31, мы выказалі здагадку, што αS і tau могуць сумесна сегрэгаваць з растваральнікам у адсутнасць РНК. кандэнсацыя.праз электрастатычныя комплексы, а αS з'яўляецца каркасным бялком у каацэрватах αS/Tau (гл. размеркаванне зарадаў tau на малюнку 2e).Мы заўважылі, што калі 10 мкМ αS і 10 мкМ Tau441 (які змяшчае 1 мкМ AF488-αS і 1 мкМ Atto647N-Tau адпаведна) былі змешаны разам у буферы LLPS, яны лёгка ўтварылі бялковыя агрэгаты, якія змяшчаюць абодва вавёркі, як відаць пры мікраскапіі WF.(Мал. 2а).Сумесная лакалізацыя двух бялкоў у кроплях была пацверджана канфакальнай (CF) мікраскапіяй (дадатковы малюнак 1а).Падобныя паводзіны назіраліся, калі дэкстран-70 выкарыстоўваўся ў якасці агента агрэгацыі (дадатковы малюнак 1с).Выкарыстоўваючы альбо FITC-пазначаны ПЭГ, альбо дэкстран, мы выявілі, што абодва краудингагенты былі раўнамерна размеркаваны па ўзорах, не выяўляючы ні сегрэгацыі, ні асацыяцыі (дадатковы мал. 1d).Хутчэй, гэта сведчыць аб тым, што ў гэтай сістэме яны спрыяюць раздзяленню фаз праз макрамалекулярныя эфекты краудінгу, паколькі ПЭГ з'яўляецца пераважна стабільным краудінг-агентам, як відаць у іншых сістэмах LLP33,34.Гэтыя багатыя бялком кроплі былі адчувальныя да NaCl (1 М), але не да 1,6-HD (10% аб'ём / аб'ём), што пацвярджае іх электрастатычныя ўласцівасці (дадатковы мал. 2a, b).Іх паводзіны вадкасці было пацверджана назіраннем за мілісекундамі зліцця кропель з дапамогай BF мікраскапіі (мал. 2b).
a Канфакальныя (CF) выявы каацэрватаў αS/Tau441 у буферы LLPS (10 мкМ кожнага бялку, 0,5 мкМ αS, пазначанага AF488 і Tau441, пазначанага Atto647N).b Рэпрэзентатыўныя выявы дыферэнцыяльнага інтэрферэнцыйнага кантрасту (DIC) падзей зліцця кропель αS/Tau441 (10 мкм для кожнага бялку).c Фазавая дыяграма, заснаваная на рассейванні святла (пры 350 нм) Tau441 LLPS (0–15 мкМ) у адсутнасць (злева) або прысутнасці (справа) 50 мкМ αS.Больш цёплыя колеры паказваюць на большае рассейванне.d Рассейванне святла ўзораў αS/Tau441 LLPS з павелічэннем канцэнтрацыі αS (Tau441 пры 5 мкМ, N = 2–3 паўторы ўзору, як паказана).e Схематычнае адлюстраванне некаторых варыянтаў бялку тау і розных абласцей бялку, якія выкарыстоўваюцца ў гэтым даследаванні: адмоўна зараджаны N-канцавы дамен (чырвоны), багатая пралінам вобласць (сіні), дамен звязвання мікратрубачак (MTBD, выдзелены аранжавым) і парная спіраль, якая ўтварае амилоид.вобласці нітак (PHF), размешчаныя ў межах MTBD (шэрыя).Паказана чыстая плата за рэшту (NCPR) карта Tau441.f З выкарыстаннем 1 мкМ αS, пазначанага AF488, і ΔNt-, пазначанага Atto647N, з выкарыстаннем 1 мкМ αS, пазначанага AF488, або ΔCt-αS у прысутнасці ΔNt-Tau (уверсе, 10 мкМ на бялок) або K18 (унізе, 50 мкМ на бялок). ) ) ) мікрафатаграфіі WF, кандэнсаваныя ў буферы LLPS або K18.Маштабныя палоскі на адным відарысе адлюстроўваюць маштаб усіх відарысаў на адной панэлі (20 мкм для панэляў a, b і f).Неапрацаваныя даныя для панэляў c і d падаюцца ў выглядзе файлаў неапрацаваных даных.
Каб праверыць ролю αS у гэтым працэсе LLPS, мы спачатку даследавалі ўплыў αS на стабільнасць кропель з дапамогай нефеламетрыі з выкарыстаннем павышэння канцэнтрацыі NaCl (мал. 2c).Чым вышэй канцэнтрацыя солі ва ўзорах, якія змяшчаюць αS, тым вышэй значэння рассейвання святла (пры 350 нм), што паказвае на стабілізуючую ролю αS у гэтай сістэме LLPS.Падобны эфект можна назіраць пры павелічэнні канцэнтрацыі αS (і, такім чынам, адносіны αS:Tau441) да прыбл.10-разовае павелічэнне адносна канцэнтрацыі тау (5 мкМ) (мал. 2d).Каб прадэманстраваць, што αS з'яўляецца каркасным бялком у коацерватах, мы вырашылі даследаваць паводзіны парушанага LLPS мутанта Tau, у якога адсутнічае адмоўна зараджаная N-канцавая вобласць (рэшткі 1-150, гл. мал. 2e), якая называецца ΔNt-Tau.Мікраскапія WF і нефеламетрыя пацвердзілі, што сам ΔNt-Tau не падвяргаўся LLPS (мал. 2f і дадатковы малюнак 2d), як паведамлялася раней 14. Аднак, калі αS быў дададзены ў дысперсійныя растворы гэтага ўсечанага варыянту Tau, працэс LLPS быў цалкам аднаўляецца з шчыльнасцю кропель, блізкай да шчыльнасці кропель поўнапамерных раствораў Tau і αS пры падобных умовах і канцэнтрацыях бялку.Гэты працэс таксама можна назіраць ва ўмовах нізкай макрамалекулярнай цеснаты (дадатковы мал. 2c).Роля С-канцавой вобласці αS, але не ўсёй яе даўжыні, у працэсе LLPS была прадэманстравана інгібіраваннем адукацыі кропель з выкарыстаннем С-канцавога ўсечанага варыянту αS без рэшткаў 104–140 (мал. 1а) (ΔCt- αS) бялок (мал. 2f і дадатковы малюнак 2d).Сумесная лакалізацыя αS і ΔNt-Tau была пацверджана канфакальнай флуарэсцэнтнай мікраскапіяй (дадатковы малюнак 1b).
Для далейшага тэставання механізму LLPS паміж Tau441 і αS быў выкарыстаны дадатковы варыянт Tau, а менавіта фрагмент парнага спіральнага асяродку ніткі (PHF) у дамене звязвання мікратрубачак (MTBD), які, калі змяшчае чатыры характэрныя паўтараюцца дамены, таксама шырока вядомыя як фрагмент К18 (гл. мал. 2д).Нядаўна было паведамлена, што αS пераважна звязваецца з таў-бялком, размешчаным у дамене, багатым пралінам, у паслядоўнасці, якая папярэднічае дамену, які звязвае мікратрубачкі.Аднак вобласць PHF таксама багатая станоўча зараджанымі рэшткамі (гл. малюнак 2e), асабліва лізінам (15% рэшткаў), што заахвоціла нас праверыць, ці спрыяе гэтая вобласць таксама кандэнсацыі комплексу αS/Tau.Мы заўважылі, што K18 сам па сабе не можа выклікаць LLPS пры канцэнтрацыях да 100 мкМ у правераных умовах (буфер LLPS з 15% PEG або 20% дэкстрану) (малюнак 2f).Аднак, калі мы дадалі 50 мкМ αS да 50 мкМ K18, з дапамогай нефеламетрыі (дадатковы малюнак 2d) і мікраскапіі WF (мал. 2f) назіралася хуткае адукацыю бялковых кропель, якія змяшчаюць K18 і αS.Як і чакалася, ΔCt-αS не змог аднавіць паводзіны LLPS K18 (мал. 2f).Мы адзначаем, што агрэгацыя αS/K18 патрабуе некалькі больш высокіх канцэнтрацый бялку для індукцыі LLPS у параўнанні з αS/ΔNt-Tau або αS/Tau441 пры іншых роўных умовах.Гэта ўзгадняецца з больш моцным узаемадзеяннем C-канцавой вобласці αS з тау-даменам, багатым пралінам, у параўнанні з даменам, які звязвае мікратрубачкі, як апісана раней 31 .
Улічваючы, што ΔNt-Tau не можа выконваць LLPS пры адсутнасці αS, мы абралі гэты варыянт Tau у якасці мадэлі для характарыстыкі αS/Tau LLPS, улічваючы яго прастату ў сістэмах LLPS з поўнаметражным Tau (ізатып, Tau441/Tau441).са складанымі (гетэратыпнымі, αS/Tau441) працэсамі агрэгацыі.Мы параўналі ступень агрэгацыі αS (як часткі бялку кандэнсаванай фазы, fαS,c) у сістэмах αS/Tau і αS/ΔNt-Tau з дапамогай цэнтрыфугавання і аналізу SDS-PAGE з дысперснай фазай (гл. 2e), знайшлі вельмі падобныя значэнні для ўсіх бялкоў у аднолькавай канцэнтрацыі.У прыватнасці, мы атрымалі fαS,c 84 ± 2% і 79 ± 7% для αS/Tau і αS/ΔNt-Tau адпаведна, мяркуючы, што гетэратыпнае ўзаемадзеянне паміж αS і tau пераўзыходзіць узаемадзеянне паміж малекуламі tau.паміж.
Узаемадзеянне з рознымі полікатыёнамі і ўплыў працэсу кандэнсацыі на кінэтыку αS былі ўпершыню вывучаны метадам аднаўлення флуарэсцэнцыі пасля фотаадбельвання (FRAP).Мы пратэставалі коацерваты αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau і αS/pLK (100 мкМ αS з дадаткам 2 мкМ αS AF488-αS і 100 мкМ Tau441 або ΔNt-Tau або 1 мм pLK).Дадзеныя былі атрыманы на працягу першых 30 хвілін пасля змешвання кампанентаў пробы.З рэпрэзентатыўных малюнкаў FRAP (мал. 3a, кандэнсацыя αS/Tau441) і адпаведных крывых у часе (мал. 3b, дадатковы малюнак 3) відаць, што кінетыка αS вельмі падобная на кінетыку кацэрватаў Tau441.і ΔNt-Tau, што значна хутчэй з pLK.Разлічаныя каэфіцыенты дыфузіі для αS унутры каацэрвата ў адпаведнасці з FRAP (як апісана Kang et al. 35) складаюць D = 0,013 ± 0,009 мкм2/с і D = 0,026 ± 0,008 мкм2/с для αS/Tau441 і αS/ΔNt- для сістэма αS/.pLK, Tau і D = 0,18 ± 0,04 мкм2/с адпаведна (мал. 3в).Аднак каэфіцыент дыфузіі αS у дысперснай фазе на некалькі парадкаў вышэйшы, чым ва ўсіх кандэнсаваных фазах, як вызначана флуарэсцэнтна-карэляцыйнай спектраскапіяй (FCS, гл. дадатковы малюнак 3) у тых жа ўмовах (буфер LLPS), але ў адсутнасці полікатыёнаў. (D = 8 ± 4 мкм2/с).Такім чынам, кінетыка трансляцыі αS значна зніжана ў коацерватах у параўнанні з вавёркамі ў дысперснай фазе з-за выяўленых эфектаў малекулярнага краудинга, хоць усе коацерваты захоўваюць вадкасныя ўласцівасці на працягу першых паўгадзіны пасля іх адукацыі, у адрозненне ад тау-фазы.больш хуткая кінетыка ў кандэнсаце pLK.
a–c FRAP-аналіз дынамікі αS (2% αS, пазначаны AF488) у электрастатычных каацэрватах.Рэпрэзентатыўныя выявы аналізаў αS/Tau441 FRAP у трох экзэмплярах паказаны на (а), дзе чырвоныя кружочкі паказваюць абескаляроўваюцца вобласці.Лінейка маштабу складае 5 мкм.b Сярэднія крывыя FRAP і (c) разлічаныя каэфіцыенты дыфузіі (D) для 5–6 (N) розных кропель з трох эксперыментаў з выкарыстаннем 100 мкМ αS і эквімалярных канцэнтрацый Tau441 (чырвоны) або ΔNt-Tau (сіні) або pLK (зялёны) у дзесяць разоў перавышае канцэнтрацыю LLPS.Стандартнае адхіленне крывой FRAP паказана зацененым колерам.Для параўнання каэфіцыент дыфузіі αS у дысперснай фазе быў вызначаны ў трох паўторах з дапамогай флуарэсцэнтнай карэляцыйнай спектраскапіі (FCS) (гл. дадатковы малюнак 3 і метады для атрымання дадатковай інфармацыі).d Бесперапынныя спектры ЭПР X-дыяпазону 100 мкМ TEMPOL-122-αS у буферы LLPS без якога-небудзь полікатыёну (чорны) або ў прысутнасці 100 мкМ Tau441 (чырвоны) або ΔNt-Tau (сіні) або 1 мм pLK (зялёны).На ўрэзцы паказаны павялічаны выгляд ліній моцнага поля, дзе адбываюцца найбольш драматычныя змены.e Крывыя звязвання 50 мкМ TEMPOL-122-αS з рознымі полікатыёнамі ў адсутнасць LLPS (без PEG).Паказана, што паменшаная амплітуда паласы III у параўнанні з паласой II (IIII/III) нармалізаванага спектру ЭПР павялічвае малярныя суадносіны Tau441 (чырвоны), ΔNt-Tau (сіні) і pLK (зялёны).Каляровыя лініі паказваюць адпаведнасць даным з выкарыстаннем грубай мадэлі звязвання з n аднолькавымі і незалежнымі месцамі звязвання на кожнай крывой.Неапрацаваныя даныя прадастаўляюцца ў выглядзе файлаў неапрацаваных даных.
У якасці дадатку мы даследавалі дынаміку αS у розных каацэрватах з дапамогай маркіроўкі накіраваным спінам (SDSL) і бесперапыннага электроннага парамагнітнага рэзанансу (CW-EPR).Гэты метад апынуўся вельмі карысным для ацэнкі гнуткасці і дынамікі IDP з рэалістычным рэшткавым дазволам36,37,38.З гэтай мэтай мы сканструявалі рэшткі цыстэіну ў адзінкавых мутантах Cys і выкарысталі спінавы зонд 4-гідраксі-2,2,6,6-тэтраметылпіперыдын-N-оксіл (TEMPOL).Вытворныя малеимида пазначаюць іх.Дакладней, мы ўставілі зонды TEMPOL у пазіцыі 122 або 24 αS (TEMPOL-122-αS і TEMPOL-24-αS).У першым выпадку мы нацэлены на С-канцавы ўчастак бялку, які ўдзельнічае ва ўзаемадзеянні з поликатионами.Замест гэтага пазіцыя 24 можа даць нам інфармацыю аб агульнай дынаміцы бялкоў у кандэнсаце.У абодвух выпадках сігналы ЭПР, атрыманыя для бялкоў дысперснай фазы, адпавядалі нітраксідным радыкалам у хутка рухаюцца стане.Пасля падзелу фаз у прысутнасці tau або pLK (100 мкМ TEMPOL-αS, Tau441 або ΔNt-Tau у суадносінах 1:1 або pLK у суадносінах 1:10) назіралася павелічэнне адноснай пікавай інтэнсіўнасці ў спектр ЭПР αS.Лінія страт пашырылася, што паказвае на зніжэнне кінетыкі пераарыентацыі αS у кроплях у параўнанні з бялком у разведзенай фазе (мал. 3d, дадатковы малюнак 4a).Гэтыя змены больш выяўленыя ў становішчы 122. У той час як у становішчы 24 прысутнасць pLK не паўплывала на кінэтыку зонда, у становішчы 122 форма спектральнай лініі істотна змянілася (дадатковы мал. 4а).Калі мы спрабавалі змадэляваць спектры ў пазіцыі 122 дзвюх сістэм αS/поликатионов з выкарыстаннем ізатропнай мадэлі (дадатковы малюнак 5а), якая звычайна выкарыстоўваецца для апісання дынамікі пазначаных спінам IDP38,39, мы не змаглі аднавіць эксперыментальныя спектры..Спектральнае мадэляванне становішча 24 спінавых кантрастаў (дадатковы малюнак 5а).Гэта сведчыць аб тым, што існуюць пераважныя пазіцыі ў прасторы спінавых канфігурацый С-канцавой вобласці αS у прысутнасці поликатионов.Пры разглядзе долі αS у кандэнсаванай фазе ва ўмовах эксперыментальнага ЭПР (84 ± 2%, 79 ± 7% і 47 ± 4% для αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau і αS/pLK адпаведна — гл. дадатковы На мал. 2e аналізу даных c), відаць, што пашырэнне, выяўленае метадам ЭПР, у асноўным адлюстроўвае ўзаемадзеянне С-канцавой вобласці αS з рознымі полікатыёнамі ў кандэнсаванай фазе (асноўнае змяненне пры выкарыстанні TEMPOL-122- αS), а не кандэнсацыя бялку.У зондзе назіраецца павелічэнне микровязкости.Як і чакалася, спектр ЭПР бялку ў іншых умовах, акрамя LLPS, быў цалкам адноўлены, калі ў сумесь быў дададзены 1 М NaCl (дадатковы мал. 4b).У цэлым, нашы дадзеныя сведчаць аб тым, што змены, выяўленыя CW-EPR, у асноўным адлюстроўваюць узаемадзеянне С-канцавой вобласці αS з рознымі полікатыёнамі ў кандэнсаванай фазе, і гэта ўзаемадзеянне, здаецца, больш моцнае з pLK, чым з Tau.
Для таго, каб атрымаць больш структурнай інфармацыі аб вавёрках у коацервате, мы вырашылі вывучыць сістэму LLPS з дапамогай ЯМР у растворы.Аднак мы змаглі выявіць толькі фракцыю αS, якая засталася ў дысперснай фазе, што можа быць звязана са зніжэннем дынамікі бялку ўнутры коацервата і шчыльнай фазай на дне раствора пры ЯМР-аналізе.Калі мы прааналізавалі структуру і дынаміку бялку, які застаўся ў дысперснай фазе ўзору LLPS, з дапамогай ЯМР (дадатковы малюнак 5c, d), мы заўважылі, што бялок паводзіў сябе амаль ідэнтычна ў прысутнасці pLK і ΔNt-Tau, абодва з якія былі ў другаснай структуры і дынаміцы бялковай асновы, выяўленай эксперыментамі па другасным хімічным зруху і рэлаксацыі R1ρ.Дадзеныя ЯМР паказваюць, што C-канец αS пакутуе ад значнай страты канфармацыйнай гнуткасці, захоўваючы пры гэтым сваю неўпарадкаваную прыроду, як і астатняя бялковая паслядоўнасць, з-за ўзаемадзеяння з полікатыёнамі.
Паколькі пашырэнне сігналу CW-EPR, якое назіраецца ў кандэнсаванай фазе TEMPOL-122-αS, адлюстроўвае ўзаемадзеянне бялку з полікатыёнамі, мы правялі тытраванне EPR для ацэнкі сродства звязвання αS з рознымі полікатыёнамі ў адсутнасць LLPS (без назапашвання Буфер LLPS), мяркуючы, што ўзаемадзеянне аднолькавае ў разведзенай і канцэнтраванай фазах (што пацвярджаецца нашымі дадзенымі, Дадатковы малюнак 4а і Дадатковы малюнак 6).Мэта складалася ў тым, каб убачыць, ці ўсе коацерваты, нягледзячы на ​​іх агульныя ўласцівасці, падобныя на вадкасць, праяўляюць якія-небудзь асноўныя дыферэнцыяльныя паводзіны на малекулярным узроўні.Як і чакалася, спектр ЭПР пашыраўся з павелічэннем канцэнтрацыі полікатыёнаў, што адлюстроўвае зніжэнне малекулярнай гнуткасці з-за малекулярных узаемадзеянняў усіх партнёраў па ўзаемадзеянні амаль да насычэння (мал. 3e, дадатковы малюнак 6).pLK дасягнуў гэтага насычэння пры больш нізкім малярным суадносінах (полікатыён:αS) у параўнанні з ΔNt-Tau і Tau441.Па сутнасці, параўнанне дадзеных з прыблізнай мадэллю звязвання, якая прадугледжвае наяўнасць n аднолькавых і незалежных сайтаў звязвання, паказала, што ўяўная канстанта дысацыяцыі pLK (~5 мкМ) на парадак ніжэйшая, чым у Tau441 або ΔNt-Tau (~50 мкМ). ).мкМ).Нягледзячы на ​​тое, што гэта грубая ацэнка, гэта сведчыць аб тым, што αS мае больш высокую блізкасць да больш простых полікатыёнаў з бесперапыннымі ўчасткамі станоўчага зараду.Улічваючы гэтую розніцу ў сродстве паміж αS і рознымі полікатыёнамі, мы выказалі здагадку, што іх вадкія ўласцівасці могуць па-рознаму змяняцца з цягам часу і, такім чынам, пакутаваць ад розных працэсаў LSPT.
Улічваючы вялікую перанаселенасць бялковага коацервата і амілаідную прыроду бялку, мы назіралі за паводзінамі коацервата з цягам часу, каб выявіць магчымыя працэсы LSPT.Выкарыстоўваючы BF і CF мікраскапію (малюнак 4), мы заўважылі, што αS/Tau441 у значнай ступені коацервируется ў растворы, утвараючы буйныя кроплі, якія кантактуюць і змочваюць паверхню на дне лункі/прадметнага шкла як поўныя кроплі, як і чакалася (дадатковы малюнак 7d);мы называем гэтыя ўтвораныя з дна структуры «бялковыя плыты».Гэтыя структуры заставаліся вадкімі, паколькі яны захоўвалі здольнасць да зліцця (Дадатковы малюнак 7b), і іх можна было бачыць на працягу некалькіх гадзін пасля запуску LLPS (Мал. 4 і Дадатковы малюнак 7c).Мы заўважылі, што працэс змочвання спрыяе на паверхні гідрафільных, а не гідрафобных матэрыялаў (дадатковы мал. 7а), як і чакалася для электрастатычных каацэрватаў з незбалансаванымі зарадамі і, такім чынам, з высокім электрастатычным патэнцыялам паверхні.Характэрна, што αS/ΔNt-Tau зліццё і рафтынг былі значна зніжаны, у той час як αS/pLK кандэнсатаў былі значна зніжаны (мал. 4).На працягу кароткага часу інкубацыі кроплі αS/pLK змаглі аб'яднацца і намачыць гідрафільную паверхню, але гэты працэс хутка спыніўся, і пасля 5 гадзін інкубацыі назіралася толькі абмежаванае зліццё без змочвання.– гель-кропельны пераход.
Рэпрэзентатыўныя BF (панэлі ў адценнях шэрага) і CF (правыя панэлі, αS з пазнакай AF488 зялёным) узораў каацэрватаў, якія змяшчаюць 100 мкМ αS (1% флуоресцентной меткі) у буферы LLPS у прысутнасці мікраскапічных малюнкаў 100 мкМ Tau441 (верхняя) флуарэсцэнцыя ΔNt -Tau (у цэнтры) або 1 мм pLK (унізе) пры розных часах інкубацыі і фокусных вышынях (z, адлегласць ад дна пласціны).Эксперыменты паўтараліся 4-6 разоў незалежна адзін ад аднаго з аднолькавымі вынікамі.Коацерваты αS/Tau441 змочваюцца праз 24 гадзіны, утвараючы плыты, большыя за малюнак.Лінейка маштабу для ўсіх малюнкаў складае 20 мкм.
Затым мы спыталі, ці прывядуць вялікія пулы бялку, падобныя на вадкасць, у αS/Tau441 LLPS, да агрэгацыі амілаідаў любога з даследаваных бялкоў.Мы сачылі за паспяваннем кропель αS/Tau441 з цягам часу з дапамогай мікраскапіі WF у тых жа ўмовах, што і вышэй, але з выкарыстаннем 1 мкм AF488-пазначаных αS і Atto647N-пазначаных Tau441 (мал. 5а).Як і чакалася, мы назіралі поўную лакалізацыю бялку на працягу ўсяго працэсу паспявання.Цікава, што з бл.Праз 5 гадзін у плытах назіраліся больш інтэнсіўныя некруглыя ​​структуры, якія мы назвалі «кропкамі», некаторыя з якіх былі колокализированы з αS, а некаторыя былі ўзбагачаны Tau441 (мал. 5а, белыя стрэлкі).Гэтыя плямы заўсёды назіраліся на плытах у большай ступені для αS/ΔNt-Tau, чым для αS/ΔNt-Tau.У кроплях сістэм pLK і Tau, непрыдатных для зліцця/змочвання, не было выразных плям.Каб праверыць, ці з'яўляюцца гэтыя плямы, якія змяшчаюць αS і Tau441, падобнымі на амілаід агрэгатамі, мы правялі аналагічны эксперымент з выкарыстаннем CF-мікраскапіі, у якім Tau441 быў пазначаны Atto647N і з самага пачатку быў дададзены 12,5 мкМ амілаід-спецыфічнага тыафлавіну-Т (ThT).фарбавальнік.Нягледзячы на ​​​​тое, што ThT-афарбоўванне кропель αS/Tau441 або плытоў не назіралася нават пасля 24 гадзін інкубацыі (мал. 5b, верхні радок - астатнія кроплі над бялковымі плытамі), ThT-станоўчыя структуры, якія змяшчаюць Atto647N-Tau441 унутры плытоў, былі вельмі слабымі.гэта паўтарае памер, форму і месцазнаходжанне раней апісаных плям (мал. 5b, сярэдні і ніжні шэрагі), што сведчыць аб тым, што плямы могуць адпавядаць амілаідападобным агрэгатам, якія ўтвараюцца ў старэючых вадкіх коацерватах.
WF 25 мкМ αS пры розных часах інкубацыі і фокусных вышынях (z, адлегласць ад незвязанага дна) у прысутнасці 25 мкМ Tau441 (1 мкМ αS, пазначанага AF488 і Tau441, пазначанага Atto647N) у лунцы пласціны мікраскопа з буферам LLPS) .Шэсць эксперыментаў былі незалежна паўтораны з аналагічнымі вынікамі.b Мікраскапічная выява CF 25 мкМ αS у прысутнасці 25 мкМ Tau441 (1 мкМ Tau441, пазначанага Atto647N) і 12,5 мкМ тыафлавіну-Т (ThT).Узважаныя кроплі бялку і адкладзеныя бялковыя плыты і плямы паказаны ў верхнім і сярэднім радках адпаведна.У ніжнім радку паказаны выявы плытоў і кропель з 3 незалежных копій.Белыя стрэлкі паказваюць ThT-станоўчыя кропкі на абедзвюх панэлях.Лінейка маштабу для ўсіх малюнкаў складае 20 мкм.
Каб больш дэталёва вывучыць змены ў бялковай сетцы коацервата падчас пераходу з вадкага стану ў цвёрдае, мы выкарыстоўвалі флуарэсцэнтную візуалізацыю на працягу ўсяго жыцця (FLIM) і рэзанансную мікраскапію перадачы энергіі Фёрстэра (FRET) (малюнак 6 і дадатковыя малюнкі 8 і 9).Мы выказалі здагадку, што паспяванне каацэрвата пласта ў больш кандэнсаваную або нават падобную да цвёрдага рэчыва агрэгаваную бялковую структуру прыводзіць да больш цеснага кантакту паміж бялком і флуарэсцэнтным зондам, прымацаваным да яго, патэнцыйна ствараючы эфект гашэння, які выяўляецца ў скарочаным часе жыцця зонда (τ) , як апісана раней40.,41 ,42.Акрамя таго, для падвойных пазначаных узораў (AF488 і Atto647N у якасці донарных і акцэптарных фарбавальнікаў FRET адпаведна) гэта зніжэнне τ таксама можа суправаджацца кандэнсацыяй каацэрвату і павышэннем эфектыўнасці FRET(E) падчас LSPT.Мы кантралявалі адукацыю плыта і плямы з цягам часу ва ўзорах LLPS αS/Tau441 і αS/ΔNt-Tau (25 мкМ кожнага бялку ў буферы LLPS, які змяшчае 1 мкМ AF488, пазначаны αS і/або Atto647N, пазначаны Tau441 або ΔNt-Tau).Мы назіралі агульную тэндэнцыю ў тым, што працягласць жыцця флуарэсцэнцыі зондаў AF488 (τ488) і Atto647N (τ647N) нязначна зніжалася па меры паспявання коацерватов (мал. 6 і дадатковы малюнак 8c).Цікава, што гэта змяненне было значна ўзмоцнена для кропак у плытах (мал. 6c), паказваючы, што далейшая кандэнсацыя бялку адбылася ў кропках.У пацверджанне гэтага не было заўважана значных змен у працягласці жыцця флуарэсцэнцыі для кропель αS/ΔNt-Tau, вытрыманых на працягу 24 гадзін (дадатковы малюнак 8d), што сведчыць аб тым, што гелеўтварэнне кропель - гэта працэс, які адрозніваецца ад плямістасці і не суправаджаецца значнай малекулярнай рэарганізацыяй ўнутры коацерватов.Варта адзначыць, што кропкі маюць розныя памеры і зменнае ўтрыманне ў αS, асабліва для сістэмы αS/Tau441 (дадатковы малюнак 8e).Памяншэнне працягласці жыцця плямавай флуарэсцэнцыі суправаджалася павелічэннем інтэнсіўнасці, асабліва для Atto647N, пазначанай Tau441 (дадатковы малюнак 8а), і больш высокай эфектыўнасцю FRET як для сістэм αS/Tau441, так і для сістэм αS/ΔNt-Tau, што паказвае на далейшую кандэнсацыю ў LLPS Пяць гадзін пасля спрацоўвання вавёркі ўнутры статычнай электрычнасці кандэнсуюцца.У параўнанні з αS/ΔNt-Tau мы назіралі больш нізкія значэнні τ647N і некалькі больш высокія значэнні τ488 у плямах αS/Tau441, якія суправаджаліся больш нізкімі і неаднароднымі значэннямі FRET.Магчыма, гэта можа быць звязана з тым, што ў сістэме αS/Tau441 назіраная і чаканая колькасць αS у агрэгатах больш неаднародная, часта субстехиометрическая ў параўнанні з Tau, паколькі сам Tau441 таксама можа падвяргацца LLPS і агрэгацыі (дадатковы малюнак 8e) .Аднак ступень зліцця кропель, фарміравання плыта і, што важна, агрэгацыі бялкоў у вадкасных коацерватах максімальная, калі прысутнічаюць і Tau441, і αS.
выявы αS/Tau441 і αS/ΔNt-Tau з дапамогай флюарэсцэнтнай мікраскапіі (FLIM) пры 25 мкМ кожнага бялку (1 мкМ αS, пазначанага AF488, і 1 мкМ Tau441 або ΔNt-Tau, пазначанага Atto647N) у буферы LLPS.Слупкі паказваюць рэпрэзентатыўныя выявы узораў LLPS у розныя часы паспявання (30 мін, 5 гадзін і 24 гадзіны).Чырвоная рамка паказвае вобласць, якая змяшчае плямы αS/Tau441.Працягласць жыцця паказана каляровымі палоскамі.Маштабная паласа = 20 мкм для ўсіх малюнкаў.b Павялічаны відарыс FLIM выбранай вобласці, паказаны ў чырвоным полі на панэлі a.Дыяпазоны жыцця паказаны з выкарыстаннем той жа каляровай шкалы, што і на панэлі а.Шкала = 5 мкм.c Гістаграмы, якія паказваюць AF488 (далучаны да αS) або Atto647N (далучаны да Tau) для розных відаў бялку (кропелькі-D-, плыт-R- і спекл-P), ідэнтыфікаваных на выявах FLIM, запісаных для αS-), часавыя размеркаванні, працягласць жыцця Tau441 і Узоры каацэрватаў αS/ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI для D, 29-44 ROI для R і 21-51 ROI для кропак).Сярэдняе і сярэдняе значэнні паказаны жоўтымі квадратамі і чорнымі лініямі ўнутры палёў адпаведна.Ніжняя і верхняя межы скрынкі ўяўляюць першы і трэці квартыль адпаведна, а мінімальныя і максімальныя значэнні ў межах 1,5-кратнага межквартильного дыяпазону (IQR) паказаны ў выглядзе вусоў.Выкіды паказаны чорнымі ромбамі.Статыстычная значнасць паміж парамі размеркаванняў была вызначана з дапамогай двухвыбаркавага t-крытэрыю, мяркуючы, што дысперсіі няроўныя.Двухбаковы t-крытэрый p-значэння паказаны зорачкамі для кожнай пары параўноўваных даных (* p-значэнне > 0,01, ** p-значэнне > 0,001, *** p-значэнне > 0,0001, **** p-значэнне > 0,00001), ns Паказвае нязначнасць (p-значэнне > 0,05).Дакладныя значэнні р прыведзены ў дадатковай табліцы 1, а зыходныя дадзеныя прадстаўлены ў выглядзе файлаў зыходных даных.
Каб дадаткова прадэманстраваць амілаідападобную прыроду крапінак/агрэгатаў, мы апрацоўвалі неафарбаваныя ўзоры коацерватов на працягу 24 гадзін высокай канцэнтрацыяй (1 М) NaCl, што прывяло да аддзялення агрэгатаў ад бялковых коацерватов.Калі з дапамогай атамна-сілавой мікраскапіі (АСМ) назіралі ізаляваныя агрэгаты (г.зн. дысперсны раствор агрэгатаў), мы назіралі пераважна сферычную марфалогію з звычайнай вышынёй каля 15 нм, якая мае тэндэнцыю да асацыяцыі ва ўмовах высокай канцэнтрацыі солі, падобна паводзіны тыповых амілаідных фібрыл з-за моцнага гідрафобнага эфекту на паверхні (звярніце ўвагу, што фібрылы звычайна маюць вышыню ~10 нм) (дадатковы малюнак 10а).Цікава, што калі ізаляваныя агрэгаты інкубавалі з ThT у стандартным аналізе флуарэсцэнцыі ThT, мы назіралі рэзкае павелічэнне квантавага выхаду флуарэсцэнцыі ThT, параўнальнае з тым, што назіралася, калі фарбавальнік інкубавалі з тыповымі амілаіднымі фібрыламі αS (дадатковы мал. 10b), што сведчыць аб тым, што коацерватные агрэгаты ўтрымліваюць амилоидоподобные структуры..Фактычна, агрэгаты былі талерантнымі да высокіх канцэнтрацый солі, але адчувальнымі да 4 М гуанідынхларыду (GdnHCl), як тыповыя амілаідныя фібрылы (дадатковы малюнак 10c).
Затым мы прааналізавалі склад агрэгатаў з дапамогай флуарэсцэнцыі адной малекулы, спектраскапіі карэляцыі/крос-карэляцыі спецыфічнай флуарэсцэнцыі (FCS/FCCS) і выбуховага аналізу выяўлення двухколерных супадзенняў (TCCD).З гэтай мэтай мы ізалявалі агрэгаты, якія ўтварыліся пасля 24 гадзін інкубацыі ў 100 мкл узораў LLPS, якія змяшчаюць αS і Tau441 (абодва 25 мкМ) разам з 1 мкМ AF488-пазначаных αS і 1 мкМ Atto647N-пазначаных Tau441.Развядзіце атрыманы раствор дысперснага агрэгата да монамалекулярнага стану, выкарыстоўваючы той жа буфер без ПЭГ і 1 М NaCl (той жа буфер, які выкарыстоўваецца для аддзялення агрэгатаў ад коацервата), каб прадухіліць любыя магчымыя электрастатычныя ўзаемадзеянні паміж LLPS і бялком.Прыклад часовай траекторыі адной малекулы можна ўбачыць на мал. 7а.Аналіз FCCS/FCS (перакрыжаваная карэляцыя, CC і аўтакарэляцыя, AC) паказаў, што агрэгаты, якія змяшчаюць αS і tau, былі ў вялікай колькасці ва ўзорах (гл. крывую CC на мал. 7b, левая панэль), і лішак рэшткавага манамернага бялку ўзнік як вынік працэсу развядзення (гл. крывыя AC на малюнку 7b, левая панэль).Кантрольныя эксперыменты, выкананыя ў тых жа ўмовах раствора з выкарыстаннем узораў, якія змяшчаюць толькі манамерныя вавёркі, не паказалі крывых CC, а крывыя AC добра адпавядаюць мадэлі аднакампанентнай дыфузіі (ур. 4), дзе манамерныя вавёркі маюць чаканыя каэфіцыенты дыфузіі (мал. 7b). ), правая панэль).Каэфіцыент дыфузіі агрэгаваных часціц менш за 1 мкм2/с, а манамерных бялкоў — каля 1 мкм2/с.50–100 мкм/с;значэнні аналагічныя раней апублікаваным значэнням для апрацаваных ультрагукам амілаідных фібрыл αS і манамерных αS асобна ў аналагічных умовах раствора44.Калі мы прааналізавалі агрэгаты з дапамогай аналізу выбуху TCCD (мал. 7c, верхняя панэль), мы выявілі, што ў кожным ізаляваным агрэгаце (гетэраагрэгат αS/Tau) каля 60% выяўленых агрэгатаў утрымлівалі як αS, так і tau, каля 30% утрымлівалі толькі tau, толькі каля 10% αS.Стэхіаметрычны аналіз гетэраагрэгатаў αS/Tau паказаў, што большасць гетэраагрэгатаў былі ўзбагачаны тау (стэхіметрыя ніжэй за 0,5, сярэдняя колькасць малекул тау на агрэгат у 4 разы больш, чым малекул αS), што супадае з нашай працай, назіранай у FLIM in situ эксперыменты..Аналіз FRET паказаў, што гэтыя агрэгаты ўтрымліваюць абодва бялку, хоць фактычныя значэння FRET у дадзеным выпадку не маюць вялікага значэння, паколькі размеркаванне флюарафораў у кожным агрэгаце было выпадковым з-за лішку немеченого бялку, які выкарыстоўваўся ў эксперыменце.Цікава, што калі мы праводзілі той жа аналіз з выкарыстаннем 45,46 спелага варыянту Tau з дэфіцытам агрэгацыі амілоіду (гл. Дадатковы малюнак 11a,b), мы заўважылі, што, хоць электрастатычная агрэгацыя αS была такой жа (Дадатковы малюнак 11c, d), здольнасць утвараць агрэгаты ў каацэрваце была рэзка зніжана, і FLIM выявіў некалькі плям у эксперыментах in situ, а для ізаляваных узораў агрэгатаў назіраліся слабыя крывыя карэляцыі.Аднак для невялікай колькасці выяўленых агрэгатаў (толькі адна дзесятая Tau441) мы заўважылі, што кожны агрэгат быў узбагачаны αS, чым гэты варыянт Tau, прычым прыкладна 50% выяўленых агрэгатаў утрымлівалі толькі малекулы αS, а αS быў гетэрагенным у лішку .агрэгаты (гл. Дадатковую мал. 11e), у адрозненне ад гетэрагенных агрэгатаў, спароджаных Tau441 (мал. 6f).Вынікі гэтых эксперыментаў паказалі, што хоць αS сам па сабе здольны назапашвацца разам з тау ў каацэрваце, зараджэнне таў у гэтых умовах больш спрыяльнае, і атрыманыя амілаідападобныя агрэгаты здольныя дзейнічаць як форма αS і тау.Аднак, як толькі ўтворыцца ядро, багатае тау, гетэратыпічныя ўзаемадзеянні паміж αS і тау аддаюць перавагу ў агрэгатах, чым гаматыпічныя ўзаемадзеянні паміж малекуламі тау;мы таксама назіраем бялковыя сеткі ў вадкіх коацерватах αS/tau.
Рэпрэзентатыўныя часовыя сляды флуарэсцэнцыі асобных малекул ізаляваных агрэгатаў, утвораных у электрастатычных каацэрватах αS/Tau441.Усплёскі, якія адпавядаюць каагрэгатам αS/Tau441 (ўсплёскі вышэй пазначанага парога), назіраліся ў трох каналах выяўлення (выпраменьванне AF488 і Atto647N пасля прамога ўзбуджэння, сінія і чырвоныя лініі, выпраменьванне Atto647N пасля ўскоснага ўзбуджэння), FRET, фіялетавая лінія).b FCS/FCCS аналіз узору ізаляваных агрэгатаў αS/Tau441, атрыманых з LLPS (левая панэль).Крывыя аўтакарэляцыі (AC) для AF488 і Atto647N паказаны сінім і чырвоным адпаведна, а крывыя ўзаемнай карэляцыі (CC), звязаныя з агрэгатамі, якія змяшчаюць абодва фарбавальнікі, паказаны фіялетавым.Крывыя AC адлюстроўваюць прысутнасць пазначаных мономерных і агрэгаваных відаў бялку, у той час як крывыя CC паказваюць толькі дыфузію двайны пазначаных агрэгатаў.Той жа аналіз, але ў тых жа ўмовах раствора, што і ў асобных плямах, узоры, якія змяшчаюць толькі манамерныя αS і Tau441, паказаны ў якасці кантролю на правай панэлі.c Флуарэсцэнтны флэш-аналіз асобных малекул ізаляваных агрэгатаў, утвораных у электрастатычных каацэрватах αS/Tau441.Інфармацыя для кожнага агрэгата, знойдзенага ў чатырох розных паўторах (N = 152), наносіцца на графік у залежнасці ад іх стэхіаметрыі, значэнняў S і эфектыўнасці FRET (верхняя панэль, каляровая паласа адлюстроўвае з'яўленне).Можна вылучыць тры тыпы агрэгатаў: -αS-толькі агрэгаты з S~1 і FRET~0, Tau-толькі агрэгаты з S~0 і FRET~1 і гетэрагенныя Tau/αS агрэгаты з прамежкавымі S і FRET Ацэнкі колькасці абодвух маркерных бялкоў, выяўленых у кожным гетэрагенным агрэгаце (N = 100), паказаны на ніжняй панэлі (каляровая шкала адлюстроўвае з'яўленне).Неапрацаваныя даныя прадастаўляюцца ў выглядзе файлаў неапрацаваных даных.
Паведамляецца, што паспяванне або старэнне вадкіх бялковых кандэнсатаў у гелепадобныя або цвёрдыя структуры з цягам часу ўдзельнічае ў некалькіх фізіялагічных функцыях кандэнсату47, а таксама ў хваробах, як ненармальны працэс, які папярэднічае агрэгацыі амілоідаў 7, 48, 49. Тут мы дэталёва вывучаем падзел фаз і паводзіны.LSPT αS у прысутнасці выпадковых палікатыёнаў у кантраляваным асяроддзі пры нізкіх мікрамалярных канцэнтрацыях і фізіялагічна адпаведных умовах (звярніце ўвагу, што разліковая фізіялагічная канцэнтрацыя αS складае >1 мкМ50), у адпаведнасці з тыповымі тэрмадынамічнымі паводзінамі LPS.Мы выявілі, што αS, які змяшчае вельмі адмоўна зараджаную С-канцавую вобласць пры фізіялагічным pH, здольны ўтвараць багатыя бялком кроплі ў водным растворы праз LLPS у прысутнасці высокакатыённых неўпарадкаваных пептыдаў, такіх як pLK або Tau, праз працэс электрастатычнага складаная кандэнсацыя ў прысутнасці агрэгацыйных макрамалекул.Гэты працэс можа мець адпаведныя эфекты ў клеткавым асяроддзі, дзе αS сутыкаецца з рознымі полікатыённымі малекуламі, звязанымі з яго агрэгацыяй, звязанай з захворваннем, як in vitro, так і in vivo51,52,53,54.
У многіх даследаваннях дынаміка бялку ўнутры кропель разглядалася як адзін з ключавых фактараў, якія вызначаюць працэс паспявання55,56.У электрастатычных αS коацерватов з поликатионами працэс паспявання, відаць, залежыць ад сілы ўзаемадзеяння з поликатионами, валентнасці і кратнасці гэтых узаемадзеянняў.Тэорыя раўнавагі мяркуе, што раўнаважны ландшафт двух вадкіх станаў будзе заключацца ў наяўнасці вялікай кроплі, багатай біяпалімерамі, якія рухаюць LLPS57,58.Рост кроплі можа быць дасягнуты паспяваннем Оствальда59, зліццём60 або спажываннем вольнага манамера ў дысперснай фазе61.Для αS і Tau441, ΔNt-Tau або pLK большая частка бялку была сканцэнтравана ў кандэнсаце ва ўмовах, якія выкарыстоўваліся ў гэтым даследаванні.Аднак у той час як поўнапамерныя кроплі tau хутка зліваліся пры змочванні паверхні, зліццё кропель і змочванне былі складанымі для ΔNt-Tau і pLK, што сведчыць аб хуткай страце ўласцівасцей вадкасці ў гэтых дзвюх сістэмах.Згодна з нашым аналізам FLIM-FRET, састарэлыя кроплі pLK і ΔNt-Tau прадэманстравалі такую ​​ж ступень агрэгацыі бялку (такі ж час жыцця флуарэсцэнцыі), што і зыходныя кроплі, што сведчыць аб тым, што першапачатковая бялковая сетка захавалася, хоць і больш жорсткая.
Мы рацыяналізуем нашы эксперыментальныя вынікі ў наступнай мадэлі (малюнак 8).Першапачаткова часова ўтвораныя кроплі часта з'яўляюцца бялковымі сеткамі без электрастатычнай кампенсацыі, і, такім чынам, узнікаюць зоны дысбалансу зарадаў, асабліва на мяжы падзелу кропель, што прыводзіць да кропель з высокім электрастатычным патэнцыялам паверхні.Каб кампенсаваць зарад (феномен, які звычайна называюць знясіленнем валентнасці) і мінімізаваць патэнцыял паверхні кропель, кроплі могуць уключаць новыя поліпептыды з разведзенай фазы, рэарганізаваць бялковыя сеткі для аптымізацыі ўзаемадзеяння зарад-зарад і ўзаемадзейнічаць з іншымі кроплямі.з паверхнямі (змочванне).Кропелькі αS/pLK з-за іх больш простай бялковай сеткі (толькі гетэратыпічныя ўзаемадзеяння паміж αS і pLK) і большай блізкасці да бялкова-бялковых узаемадзеянняў, здаецца, здольныя хутчэй збалансаваць зарад кандэнсату;сапраўды, мы назіралі больш хуткую кінэтыку бялку ў першапачаткова сфармаваных коацерватах αS/pLK, чым у αS/Tau.Пасля знясілення валентнасці ўзаемадзеянне становіцца менш эфемерным, і кроплі губляюць свае вадкія ўласцівасці і ператвараюцца ў гелепадобныя, негаручыя кроплі з нізкім электрастатычным павярхоўным патэнцыялам (і таму не здольныя намачыць паверхню).Наадварот, кроплі αS/Tau менш эфектыўныя пры аптымізацыі балансу зарада кропель з-за больш складаных бялковых сетак (як з гаматыпічнымі, так і з гетэратыпічнымі ўзаемадзеяннямі) і больш слабой прыроды ўзаемадзеяння бялкоў.Гэта прыводзіць да таго, што кроплі захоўваюць вадкія паводзіны на працягу працяглых перыядаў часу і дэманструюць высокі электрастатычны павярхоўны патэнцыял, які мінімізуецца за кошт зліцця і росту (такім чынам мінімізуючы суадносіны плошчы паверхні/аб'ёму кропель) і змочвання гідрафільнай паверхні.Гэта стварае вялікія канцэнтраваныя бібліятэкі бялку, якія захоўваюць уласцівасці вадкасці, паколькі ўзаемадзеянне застаецца вельмі кароткачасовым з-за пастаяннага пошуку аптымізацыі зарада ў бялковай сетцы.Цікава, што N-канцавыя ўсечаныя формы Tau, у тым ліку некаторыя ізаформы, якія сустракаюцца ў прыродзе 62 , дэманструюць прамежкавыя паводзіны, пры гэтым некаторыя коацерваты старэюць з αS у доўгажывучыя гелепадобныя кроплі, а іншыя ператвараюцца ў вялікія вадкія кандэнсаты.Гэтая дваістасць у паспяванні электрастатычных каацэрватаў αS адпавядае нядаўнім тэарэтычным і эксперыментальным даследаванням LLPS, якія выявілі карэляцыю паміж знясіленнем валентнасці і электрастатычным прасейваннем у кандэнсатах як ключ да кантролю памеру кандэнсату і ўласцівасцей вадкасці.Механізм 58.61.
Гэтая схема паказвае меркаваны шлях агрэгацыі амілоіду для αS і Tau441 праз LLPS і LSPT.З дадатковымі багатымі аніёнамі (чырвоны) і багатымі катыёнамі (сіні) абласцямі электрастатычныя каацэрваты αS і tau з здавальняючай валентнасцю маюць меншую павярхоўную энергію і, такім чынам, меншую зліццё, што прыводзіць да хуткага старэння кропель.Дасягаецца стабільны неагломерированный стан геля..Гэтая сітуацыя вельмі спрыяльная ў выпадку сістэмы αS/pLK з-за яе больш высокага сродства і больш простай сеткі ўзаемадзеяння бялкоў і пар, што дазваляе хуткі гелепадобны пераход.Наадварот, кроплі з нездавальняючай валентнасцю і, такім чынам, зараджаныя бялком вобласці, даступныя для ўзаемадзеяння, палягчаюць каацэрвату зліццё і змочванне гідрафільнай паверхні, каб паменшыць яе высокую павярхоўную энергію.Такая сітуацыя з'яўляецца пераважнай для каацэрватаў αS/Tau441, якія маюць шматвалентную комплексную сетку, якая складаецца са слабых узаемадзеянняў Tau-Tau і αS-Tau.У сваю чаргу, больш буйныя коацерваты лягчэй захоўваюць свае падобныя на вадкасць ўласцівасці, што дазваляе іншым бялковым узаемадзеянням адбывацца.У рэшце рэшт у коацерватной вадкасці ўтвараюцца гетэрагенныя агрэгаты амілоіду, якія змяшчаюць як αS, так і тау, што можа быць звязана з тымі, якія знаходзяцца ў цельцах уключэнняў, якія з'яўляюцца прыкметамі нейрадэгенератыўных захворванняў.
Вялікія падобныя на вадкасць структуры, якія ўтвараюцца падчас паспявання αS/Tau441 з моцна перагружаным, але дынамічным бялковым асяроддзем і, у меншай ступені, каацэрваты αS/ΔNt-Tau з'яўляюцца ідэальнымі рэзервуарамі для зараджэння агрэгацыі бялку.Мы сапраўды назіралі адукацыю цвёрдых бялковых агрэгатаў у гэтым тыпе бялковых коацерватов, якія часта змяшчаюць як αS, так і тау.Мы паказалі, што гэтыя гетэраагрэгаты стабілізуюцца неэлектрастатычнымі ўзаемадзеяннямі, здольныя звязваць спецыфічныя для амілоіду фарбавальнікі ThT такім жа чынам, як тыповыя амілаідныя фібрылы, і сапраўды маюць падобную ўстойлівасць да розных уздзеянняў.Было паказана, што агрэгаты αS/tau, утвораныя LLPS, валодаюць амілаідападобнымі ўласцівасцямі.Сапраўды, спелы варыянт Tau з дэфіцытам амілаіднай агрэгацыі значна парушаецца пры фарміраванні гэтых гетэрагенных агрэгатаў αS у вадкім электрастатычным коацервате.Утварэнне агрэгатаў αS/Tau441 назіралася толькі ўнутры коацерватов, якія захоўвалі падобныя на вадкасць ўласцівасці, і ніколі, калі коацерваты/кроплі не дасягалі стану геля.У апошнім выпадку падвышаная сіла электрастатычнага ўзаемадзеяння і, як вынік, калянасць бялковай сеткі прадухіляюць неабходныя конформационные перабудовы бялкоў для ўстанаўлення новых бялковых узаемадзеянняў, неабходных для нуклеации амилоида.Аднак гэта можа быць дасягнута ў больш гнуткіх, падобных на вадкасць коацерватах, якія, у сваю чаргу, часцей застаюцца вадкімі па меры павелічэння памеру.
Той факт, што ўтварэнне агрэгатаў у кандэнсаванай фазе з'яўляецца пераважней у вялікіх кандэнсатах αS/Tau, чым у маленькіх кроплях, якія хутка гелеобразуются, падкрэслівае важнасць вызначэння фактараў, якія кантралююць зліццё кропель.Такім чынам, існуе не толькі тэндэнцыя да падзелу фаз, але і неабходна кантраляваць памер кандэнсату для правільнага функцыянавання, а таксама для прафілактыкі захворванняў58,61.Нашы вынікі таксама падкрэсліваюць важнасць балансу паміж LLPS і LSPT для сістэмы αS/Tau.У той час як адукацыя кропель можа абараніць ад агрэгацыі амілоідаў за кошт памяншэння колькасці бялковых манамераў, даступных ва ўмовах насычэння, як было прапанавана ў іншых сістэмах 63,64, зліццё кропель на высокіх узроўнях кропель можа прывесці да ўнутранай агрэгацыі бялку праз павольныя канфармацыйныя перабудовы.бялковыя сеткі..
У цэлым, нашы дадзеныя моцна падкрэсліваюць значнасць згуртаванай валентнасці і задаволеных/незадаволеных узаемадзеянняў у кропкавых сетках у кантэксце LSPT.У прыватнасці, мы паказваем, што поўнаметражныя кандэнсаты αS/Tau441 здольныя эфектыўна злівацца і зараджацца з адукацыяй амілаідападобных гетэраагрэгатаў, якія ўключаюць абодва бялкі, і прапануем малекулярны механізм, заснаваны на нашых эксперыментальных выніках.Каагрэгацыя двух бялкоў у каацэрваце вадкасці αS/Tau, пра якую мы паведамляем тут, сапраўды можа быць звязана з сумеснай лакалізацыяй двух бялкоў ва ўключэннях, якія з'яўляюцца характэрнымі прыкметамі захворвання, і можа спрыяць разуменню ўзаемасувязі паміж LLPS і агрэгацыі амілоідаў, што адкрывае шлях для высока зараджанага IDP пры нейрадэгенерацыі.
Манамерныя WT-αS, мутанты цыстэіну (Q24C-αS, N122C-αS) і варыянты ΔCt-αS (Δ101-140) экспрэсіравалі ў E. coli і ачышчалі, як апісана раней.5 мМ DTT быў уключаны ва ўсе этапы ачысткі мутантаў цистеина αS, каб прадухіліць адукацыю дысульфіднай сувязі.Ізаформа Tau441 (плазміда, атрыманая з Addgene #16316), варыянт ΔNt-Tau (Δ1–150, атрыманы шляхам кланавання IVA з праймерамі CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) і варыянт AggDef-Tau (Δ275–311, вычышчаны GGCTC 5 грунтоўка) культуры E. coli былі вырасла да OD600 = 0,6-0,7 пры 37°C і 180 абаротаў у хвіліну, і экспрэсію індукавалі IPTG на працягу 3 гадзін пры 37°C.Збіраюць клеткі пры 11500 х г на працягу 15 хвілін пры 4 °C і прамываюць солевым буферам, які змяшчае 150 мм NaCl.Рэсуспендуйце асадак у буферы для лізісу (20 мл на 1 л LB: MES 20 ммоль, pH 6,8, NaCl 500 ммоль, EDTA 1 ммоль, MgCl2 0,2 ​​ммоль, DTT 5 ммоль, PMSF 1 ммоль, бензамідзін 50 мкМ, копептин 100 мкМ).Крок апрацоўкі ультрагукам праводзіўся на лёдзе з амплітудай 80% на працягу 10 імпульсаў (1 мін уключана, 1 мін выключана).Не перавышайце 60 мл за адно УГД.Лізаты E. coli награвалі пры 95°C на працягу 20 хвілін, затым астуджалі на лёдзе і центрифугировали пры 127000×g на працягу 40 хвілін.Асветлены супернатант наносілі на мембрану 3,5 кДа (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, Вялікабрытанія) і дыялізавалі супраць 4 л дыялізнага буфера (20 мМ MES, pH 6,8, NaCl 50 мм, EDTA 1 мм, MgCl2 2 мм, DTT 2 мм , PMSF 0,1 мМ) на працягу 10 гадзін.Катыёнаабменную калонку аб'ёмам 5 мл (HiTrap SPFF, Cytiva, Масачусэтс, ЗША) ураўнаважвалі ўраўнаважваючым буферам (20 ммоль MES, pH 6,8, 50 ммоль NaCl, 1 ммоль ЭДТА, 2 ммоль MgCl2, 2 ммоль DTT, 0,1 ммоль PMSF).Таў-лізат фільтравалі праз 0,22 мкм PVDF фільтр і ўводзілі ў калонку з хуткасцю патоку 1 мл/мін.Элюцию праводзілі паступова, тау элюировали 15-30% элюционным буферам (20 мМ MES, рн 6,8, 1 М NaCl, 1 мМ ЭДТА, 2 мМ MgCl2, 2 мМ DTT, 0,1 мМ PMSF).Фракцыі аналізавалі з дапамогай SDS-PAGE, і любыя фракцыі, якія змяшчаюць адну паласу з чаканай малекулярнай масай тау, канцэнтравалі з дапамогай цэнтрыфужнага фільтра 10 кДа і замянялі буферам, які змяшчае 10 мМ HEPES, pH 7,4, NaCl 500 мМ і DTT 2 мм для канчатковая канцэнтрацыя бялку складала 100 мкМ.Раствор бялку затым прапускалі праз 0,22 мкм PVDF фільтр, хутка замарожвалі і захоўвалі пры -80°C.Пратэін K18 быў ласкава прадастаўлены прафесарам Альберта Бофі.Чысціня прэпарата была >95%, як пацверджана SDS-PAGE і MALDI-TOF/TOF.Розныя цыстэіны былі хімічна пазначаны малеімідам AlexaFluor488 (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ЗША) або малеімідам TEMPOL (Toronto Research Chemicals, Таронта, Канада).былі пацверджаны абсорбцыяй і MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau і K18 пазначалі натыўнымі рэшткамі цыстэіну ў пазіцыях 191 і 322 з выкарыстаннем Atto647N-малеіміду (ATTO-TEC GmbH, Зіген, Германія) па той жа працэдуры.Карты чыстага зарада на астатак для αS і Tau441 былі створаны з дапамогай CIDER66.
Цвёрды полі-L-лізін (pLK DP 90-110 у адпаведнасці з ЯМР ад пастаўшчыка, Alamanda Polymers Inc, Хантсвіл, штат Алабама, ЗША) раствараюць у 10 мм HEPES, 100 мм NaCl, канцэнтрацыя pH ад 7,4 да 10 мм, апрацоўваюць ультрагукам на працягу 5 хвілін на ультрагукавой вадзяной лазні і захоўваць пры -20°C.ПЭГ-8, декстран-70, FITC-ПЭГ-10 (Biochempeg, Watertown, Масачусэтс, ЗША) і FITC-декстран-500 (Sigma-Aldrich, Сант-Луіс, Мічыган, ЗША) раствараюцца ў вадзе і шырока распаўсюджаны ў буферы LLPS.Дыяліз выдаляе забруджвальныя солі.Затым іх фільтравалі праз шпрыц-фільтр з памерам пор 0,22 мкм і вылічвалі іх канцэнтрацыі з дапамогай рефрактометра (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).Узоры LLPS рыхтавалі пры пакаёвай тэмпературы ў наступным парадку: буфер і экструзію змешвалі і 1 ммоль трыс(2-карбаксіэтыл)фасфіну (TCEP, Carbosynth, Compton, Вялікабрытанія), 1 ммоль 2,2,2,2-(этан- 1, 2-диилдинитрил) тетрауксусной кіслаты (ЭДТА, карбоксинт) і сумесі 1% інгібітару протеазы (PMSF 100 мМ, бензімід 1 мМ, лейпептин 5 мкМ).Затым дадаюцца αS і злітыя полікатыёны (варыянты pLK або Tau).Для эксперыментаў з часавымі шэрагамі тыафлавіну-Т (ThT, Carbosynth, Compton, Вялікабрытанія) выкарыстоўвайце агульную канцэнтрацыю ThT, якая роўная палове канцэнтрацыі αS.Асцярожна, але старанна змяшайце ўзоры, каб пераканацца, што яны аднастайныя.Канцэнтрацыя кожнага кампанента вар'іравалася ад эксперыменту да эксперыменту, як апісана ў раздзеле "Вынікі".Азід выкарыстоўваўся ў канцэнтрацыі 0,02% (маса / аб'ём), калі працягласць эксперыменту перавышала 4 гадзіны.Для ўсіх аналізаў з выкарыстаннем узораў LLPS дайце сумесі ўраўнаважыцца на працягу 5 хвілін перад аналізам.Для аналізу рассейвання святла 150 мкл узораў загружалі ў не звязваючыя 96-лункавыя мікрапланшаты (µClear®, чорны, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Аўстрыя) і пакрывалі клейкай плёнкай.LLP кантралявалі шляхам вымярэння паглынання пры 350 нм у цэнтры раствора ў прыладзе для чытання пласцін CLARIOstar (BMG Labtech, Ортэнберг, Германія).Эксперыменты праводзіліся ў трох паўторах пры 25 ° C, а памылкі разлічваліся як стандартнае адхіленне ад сярэдняга значэння.Разведзеная фаза была вызначана колькасна шляхам цэнтрыфугавання ўзораў і аналізу геля ў SDS-PAGE, а фракцыя αS у разведзенай і канцэнтраванай фазах была вызначана колькасна ў розных растворах LLPS.Узор LLPS аб'ёмам 100 мкл, які змяшчае 1 мкМ αS, пазначаны AF488, быў падрыхтаваны шляхам дбайнага змешвання з наступным цэнтрыфугаваннем пры 9600 × g на працягу 30 хвілін, пасля чаго звычайна быў бачны асадак.Верхнія 50 мкл супернатанта выкарыстоўвалі для колькаснага вызначэння бялку з дапамогай SDS-PAGE геля.Гелі сканавалі з дапамогай фільтраў AF488 з выкарыстаннем сістэмы візуалізацыі геля ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Каліфорнія, ЗША) або афарбоўвалі плямай Кумасі і візуалізавалі з дапамогай адпаведных фільтраў.Атрыманыя паласы былі прааналізаваны з дапамогай ImageJ версіі 1.53i (Нацыянальны інстытут аховы здароўя, ЗША).Эксперыменты праводзіліся ў двух экземплярах у двух розных эксперыментах з аднолькавымі вынікамі.
Як правіла, 150 мкл узораў наносілі на не звязваючыя 96-лункавыя мікрапланшаты і візуалізавалі пры пакаёвай тэмпературы на інвертаваным мікраскопе Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Германія).Для кропкавых эксперыментаў таксама выкарыстоўваліся пласціны для ангіягенезу µ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Германія) або 96-лункавыя полістыролавыя мікрапланшэты (Corning Costar Corp., Acton, Масачусэтс).У якасці крыніц асвятлення выкарыстоўваліся галагенавыя або ртутныя металлогалогенные лямпы EL6000 (для візуалізацыі BF/DIC і WF адпаведна).Для мікраскапіі WF выкарыстоўваўся паветраны аб'ектыў з 40-кратным павелічэннем (Leica Microsystems, Германія), каб сфакусаваць святло на ўзоры і сабраць яго.Для ўзораў з маркіроўкай AF488 і ThT фільтруйце ўзбуджэнне і выпраменьванне са стандартнымі наборамі фільтраў GFP, паласавымі фільтрамі ўзбуджэння і выпраменьвання адпаведна, паласавымі фільтрамі 460–500 нм і 512–542 нм і дыхроічным люстэркам 495 нм.Для ўзораў, пазначаных Atto647N, выкарыстоўваўся стандартны набор фільтраў Cy5 з паласавымі фільтрамі ўзбуджэння і выпраменьвання 628–40 нм і 692–40 нм адпаведна і дыхроічным люстэркам 660 нм.Для мікраскапіі BF і DIC выкарыстоўвайце адзін і той жа аб'ектыў для збору адлюстраванага святла.Сабраны святло быў запісаны на камеру Leica DFC7000 CCD (Leica Microsystems, Германія).Час экспазіцыі складаў 50 мс для візуалізацыі мікраскапіі BF і DIC і 20-100 мс для візуалізацыі мікраскапіі WF.Для параўнання, час экспазіцыі для ўсіх эксперыментаў з ThT складала 100 мс.Каб візуалізаваць зліццё кропель, праводзіліся эксперыменты з пакадравай здымкай, выявы збіраліся кожныя 100 мс на працягу некалькіх хвілін.Для аналізу выявы быў выкарыстаны ImageJ (NIH, ЗША).Эксперыменты праводзіліся ў трох паўторах з аналагічнымі вынікамі.
Для эксперыментаў па калалізацыі, FRAP і 3D-рэканструкцыі выявы былі атрыманы на інвертаваным канфакальным мікраскопе Zeiss LSM 880 з выкарыстаннем ZEN 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Германія).Узоры аб'ёмам 50 мкл наносілі на чашкі Петры µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Германія), апрацоўвалі гідрафільным палімерам (ibiTreat) і ўсталёўвалі ў алейны иммерсионный аб'ектыў 63× (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) на ДВС).Выявы былі атрыманы з выкарыстаннем ліній аргонавага лазера з даўжынямі даўжынь 458 нм, 488 нм і 633 нм з раздзяленнем 0,26 мкм/піксель і часам экспазіцыі 8 мкс/піксель для вокнаў выяўлення ўзбуджэння і выпраменьвання 470–600 нм, 493–628 нм, і 638–755 нм выкарыстоўваліся для візуалізацыі ThT, AF488 і Atto647N адпаведна.Для эксперыментаў FRAP пакадравая фатаграфія кожнага ўзору запісвалася з хуткасцю 1 кадр у секунду.Эксперыменты праводзіліся ў трох паўторах пры пакаёвай тэмпературы з аналагічнымі вынікамі.Усе выявы былі прааналізаваны з дапамогай праграмнага забеспячэння Zen 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Германія).Крывыя FRAP былі нармалізаваны, пабудаваны і падагнаны да дадзеных інтэнсіўнасці/часу, атрыманых з малюнкаў з дапамогай Zen 2 з дапамогай OriginPro 9.1.Крывыя аднаўлення былі падабраныя да монаэкспанентнай мадэлі для ўліку малекулярнай дыфузіі з дадатковым экспанентным членам для ўліку эфекту адбельвання пры атрыманні.Затым мы разлічылі D, выкарыстоўваючы намінальны радыус адбельвання і раней вызначаны перыяд паўраспаду аднаўлення, як у раўнанні Канга і інш.5 35 паказаны.
Адзінкавыя цистеиновые варыянты αS былі сінтэзаваны з 4-гідраксі-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-N-оксилом (TEMPOL) у пазіцыях 24 (TEMPOL-24-αS) і 122 (TEMPOL-122-αS), адпаведна.Спін-маркіроўка Для эксперыментаў ЭПР канцэнтрацыя αS была ўстаноўлена роўнай 100 мкМ, а канцэнтрацыя ПЭГ складала 15% (вага/аб'ём).Для розных умоў агрэгацыі суадносіны αS:pLK складала 1:10, у той час як суадносіны αS:ΔNt-Tau і αS:Tau441 падтрымліваліся на ўзроўні 1:1.Для эксперыментаў тытравання звязвання пры адсутнасці цеснаты TEMPOL-122-αS падтрымлівалі на ўзроўні 50 мкМ, а полікатыёны тытравалі пры ўзрастаючых канцэнтрацыях, рыхтуючы кожную ўмову асобна.Вымярэнні CW-EPR праводзіліся з выкарыстаннем спектрометра X-дыяпазону Bruker ELEXSYS E580, абсталяванага рэзанатарам Bruker ER4118 SPT-N1, які працуе на частаце мікрахвалевага выпраменьвання (ЗВЧ) ~9,7 ГГц.Тэмпературу ўсталёўвалі на 25°C і кантралявалі з дапамогай криостата з вадкім азотам.Спектры былі атрыманы ў ненасычаных умовах пры магутнасці МВт 4 мВт, амплітудзе мадуляцыі 0,1 мТл і частаце мадуляцыі 100 кГц.Спектральныя інтэнсіўнасці былі нармалізаваны, каб пазбегнуць адрозненняў у спінавых канцэнтрацыях паміж узорамі і магчымага зніжэння спіна з-за рэшткавых канцэнтрацый аднаўляльнікаў ва ўзорах, якія змяшчаюць Tau441 або ΔNt-Tau (прысутнічаюць у зыходных бялковых растворах).Прыведзеныя значэнні g былі атрыманы ў выніку спектральнага мадэлявання ЭПР, выкананага з дапамогай праграмнага забеспячэння Easyspin (v. 6.0.0-dev.34), рэалізаванага ў Matlab®67.Адна/двухкампанентныя ізатропныя мадэлі выкарыстоўваліся для мадэлявання даных.Пасля нармалізацыі ўсіх сігналаў рэшткі былі разлічаны шляхам аднімання кожнага мадэлявання з адпаведнага эксперыментальнага спектру.Для аналізу тытравання звязвання выкарыстоўвалася адносная інтэнсіўнасць трэцяй паласы да другой паласы нармалізаванага спектру ЭПР (III/III) для кантролю звязвання полікатыёнаў з αS.Для ацэнкі канстанты дысацыяцыі (Kd) атрыманая крывая падагнана да прыблізнай мадэлі, мяркуючы, што n аднолькавых і незалежных сайтаў звязвання.
Эксперыменты ЯМР-спектраскапіі праводзіліся з выкарыстаннем ЯМР-спектрометра Bruker Neo 800 МГц (1H), абсталяванага криозондом і Z-градыентам.Усе эксперыменты праводзіліся з выкарыстаннем 130-207 мкМ αS і адпаведных эквівалентаў αS/ΔNt-Tau і pLK у 10 мм HEPES, 100 мм NaCl, 10% DO, pH 7,4 і праводзіліся пры 15 °C.Для маніторынгу LPS з дапамогай ЯМР да папярэдне змешаных узораў дадаюць 10% PEG.Графік абурэння хімічнага зруху (мал. 1b) паказвае сярэднія хімічныя зрухі 1H і 15N.Спектры αS 2D1H-15N HSQC былі прызначаны на аснове папярэдняга прызначэння (запіс BMRB № 25227) і пацверджаны запісам і аналізам 3D-спектраў HNCA, HNCO і CBCAcoNH.Хімічныя зрухі 13Cα і 13Cβ былі разлічаны ў прысутнасці ΔNt-Tau або pLK, каб вымераць магчымыя змены ў тэндэнцыях другаснай структуры ў параўнанні з хімічнымі зрухамі αS у чыстай выпадковай канфармацыі шпулькі 68 (дадатковы малюнак 5c).Хуткасці R1ρ вымяраліся шляхам запісу эксперыментаў hsqctretf3gpsi (атрыманых з бібліятэкі Bruker) з затрымкамі 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 і 800 мс, і экспанентныя функцыі былі скарэкціраваны ў адпаведнасці з затрымкамі пікавай інтэнсіўнасці пры розных разоў, каб вызначыць R1ρ і яго эксперыментальную нявызначанасць.
Эксперыменты двухколернай флуарэсцэнтнай мікраскапіі з часовым дазволам праводзіліся на камерцыйным флуарэсцэнтным канфакальным мікраскопе MT200 з часовым дазволам (PicoQuant, Берлін, Германія) з прыладай для падліку адзінкавых фатонаў з часовай карэляцыяй (TCSPC).Галоўка лазернага дыёда выкарыстоўваецца для імпульснага перамежаванага ўзбуджэння (PIE), прамень праходзіць праз аднамодавы хвалявод і настроены на магутнасць лазера ад 10 да 100 нВт для лазерных ліній 481 нм і 637 нм, вымераных пасля дыхроічнага люстэрка.Гэта забяспечвае аптымальную хуткасць падліку фатонаў, пазбягаючы эфектаў згладжвання фатонаў, фотаадбельвання і насычэння.Покрыўныя шкла або пласціны для ангіягенезу μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Германія) змяшчалі непасрэдна ў ваду для апускання на лінзу Super Apochromat 60x NA 1.2 з карэкціруючым каўняром (Olympus Life Sciences, Waltham, ЗША).Дыхроічнае люстэрка 488/640 нм (Semrock, Lake Forest, IL, USA) выкарыстоўвалася ў якасці раздзяляльніка асноўнага прамяня.Нефакусіраванае выпраменьванне блакуецца адтулінай дыяметрам 50 мкм, затым сфакусаванае выпраменьванне падзяляецца на 2 шляхі выяўлення пры дапамозе раздзяляльніка пучка 50/50.Перад дэтэктарам выкарыстоўваліся паласавыя фільтры (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 для зялёнага фарбавальніка (AF488) і 690/70 для чырвонага фарбавальніка (Atto647N).У якасці дэтэктараў выкарыстоўваліся аднафатонныя лавінныя дыёды (SPAD) (Micro Photon Devices, Бальцана, Італія).Збор і аналіз дадзеных праводзіліся з выкарыстаннем камерцыйна даступнага праграмнага забеспячэння SymphoTime64 (PicoQuant GmbH, Берлін, Германія).
Пяцьдзесят мікралітраў узораў LLPS былі ўнесены ў лункі ангіягенезу μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Германія).Атрыманыя выявы факусуюцца да 20 мкм над дном свідравіны для аптымальнай рабочай адлегласці аб'ектыва для ўзважаных кропель і да ~1 мкм для плытоў і кропак з восевым разрозненнем не менш за 0,25 мкм/піксель і часам затрымкі 400 мкс/піксель.Выбірайце даныя, ужываючы парог інтэнсіўнасці на аснове сярэдняй інтэнсіўнасці фонавага сігналу (PBG, сярэдняе + 2σ) для кожнага канала, каб выбіраць толькі кроплі, плыты або плямы вадкага бялку, адфільтроўваючы любое магчымае паходжанне з дысперснай фазы.Каб прааналізаваць працягласць жыцця кожнага віду (τ) кожнага канала (зялёны, "g" для AF488 і чырвоны, "r" для Atto647N), мы выбралі цікавыя вобласці (ROI), якія змяшчаюць кроплі, плыты або плямы (дадатковы малюнак 1 ).8b) і атрымаў іх, падагнаўшы распад на працягу ўсяго жыцця (τD, τR і τP для кропель, плытоў або плям, адпаведна, гл. Дадатковы малюнак 8c) у кожным канале з дапамогай аналізу падганяння хваста і двухкампанентнай мадэлі распаду.Сярэдняе τ ад τ .ROI, якія выраблялі занадта мала фатонаў для мультыэкспанентнай падгонкі, былі выключаны з аналізу.Выкарыстанае адсячэнне было <104 фатонаў для плытоў і кропак і 103 для кропель.Кроплі маюць больш нізкі парог, таму што цяжка атрымаць крывыя распаду з больш высокімі значэннямі інтэнсіўнасці, паколькі кроплі ў полі выявы звычайна меншыя і меншыя.ROI з колькасцю фатонаў, якая перавышае ліміт назапашвання фатонаў (усталяваны на >500 адлікаў/піксель), таксама былі адкінуты для аналізу.Супастаўце крывую згасання інтэнсіўнасці, атрыманую з цікавай вобласці, з інтэнсіўнасцю на ўзроўні 90% ад максімуму (крыху пасля максімальнай інтэнсіўнасці згасання) з пачатку тэрміну службы, каб забяспечыць мінімальныя перашкоды IRF пры захаванні аднолькавага для ўсіх спадаў інтэнсіўнасці налады Адноснае часовае акно Былі прааналізаваны ад 25 да 50 ROI для плытоў і плям і 15-25 ROI для падзенняў, выявы, выбраныя з больш чым 4 копій, запісаных як мінімум з 3 незалежных эксперыментаў.Двухбаковыя t-крытэрыі выкарыстоўваліся для ацэнкі статыстычных адрозненняў паміж відамі або паміж сістэмамі коацерватов.Для папіксельнага аналізу часу жыцця (τ) было разлічана агульнае згасанне часу жыцця ў полі для кожнага канала і выканана апраксімацыя 2/3-кампанентнай экспанентнай мадэлі згасання.Згасанне за час жыцця для кожнага пікселя было затым падагнана з выкарыстаннем раней разлічаных значэнняў τ, у выніку чаго атрымаўся псеўдакаляровы FLIM-відарыс.Дыяпазон працягласці жыцця хваставой часткі быў аднолькавым на ўсіх выявах аднаго і таго ж канала, і кожны распад ствараў дастатковую колькасць фатонаў, каб забяспечыць надзейную адпаведнасць.Для аналізу FRET пікселі былі выбраны шляхам прымянення ніжняга парога інтэнсіўнасці ў 100 фатонаў, што ў сярэднім складае 11 фатонаў для фонавага сігналу (FBG).Інтэнсіўнасць флуарэсцэнцыі кожнага канала карэкціравалася з дапамогай эксперыментальна вызначаных папраўчых каэфіцыентаў: 69 спектральных перакрыжаваных перашкод α складала 0,004, прамога ўзбуджэння β была 0,0305, эфектыўнасць выяўлення γ была 0,517.Затым эфектыўнасць FRET на ўзроўні пікселяў разлічваецца з дапамогай наступнага ўраўнення:
дзе FDD - гэта інтэнсіўнасць флуарэсцэнцыі, якая назіраецца ў донарскім (зялёным) канале, FDA - гэта інтэнсіўнасць флуарэсцэнцыі, якая назіраецца ў акцэптарным (чырвоным) канале пры непрамым узбуджэнні, і FAA - гэта інтэнсіўнасць флуарэсцэнцыі, назіраная ў акцэптарным (чырвоным) канале пры прамым узбуджэнні ( ПИРОГ).У канале назіраюцца імпульсы інтэнсіўнасці флуарэсцэнцыі).
Змесціце 100 мкл рэакцыйных раствораў LLPS, якія змяшчаюць 25 мкМ немечаны манамерны Tau441 (з або без 25 мкМ αS) у буфер LLPS (з дадаткам, як паказана вышэй) на не звязваючыя 96-лункавыя мікрапланшаты з клейкім пакрыццём з фальгі, а адукацыя кропель была праверана з дапамогай WF мікраскапіі пасля ураўнаважванне.на працягу 10 мін.Пасля 48 гадзін інкубацыі пры пакаёвай тэмпературы было пацверджана наяўнасць бялковых плытоў і плям.Затым асцярожна выдаліце ​​вадкасць над плытамі з лунак, затым дадайце 50 л буфера для дысацыяцыі (10 мм HEPES, pH 7,4, 1 М NaCl, 1 мм DTT) і інкубуйце на працягу 10 хвілін.Высокая канцэнтрацыя солі гарантуе, што LLPS не паўторыцца з-за рэшткавага ПЭГ, а магчымыя зборкі бялкоў, утвораныя толькі электрастатычным узаемадзеяннем, будуць разабраны.Дно лункі затым асцярожна саскраблі наканечнікам мікрапіпеткі і атрыманы раствор перанеслі ў пустую назіральную лунку.Пасля інкубацыі узораў з 50 мкМ ThT на працягу 1 гадзіны наяўнасць ізаляваных плям правяралі з дапамогай мікраскапіі WF.Прыгатуйце апрацаваныя ультрагукам αS фібрылы шляхам інкубацыі 300 мкл 70-мкМ раствора αS у PBS з pH 7,4, азідам натрыю 0,01% пры 37 °C і 200 абаротах у хвіліну на арбітальным шейкере на працягу 7 дзён.Затым раствор центрифугировали пры 9600×g на працягу 30 хвілін, асадак ресуспендировали ў PBS рн 7,4 і апрацоўвалі ўзоры фібрыл ультрагукам (1 хвіліна, 50% цыкл, 80% амплітуда ў ультрагукавым апараце Vibra-Cell VC130, Sonics, Ньютан, ЗША). з адносна раўнамерным размеркаваннем дробных фібрыл.
Аналіз FCS/FCCS і выяўленне двухколерных супадзенняў (TCCD) праводзіліся на тым жа люмінесцэнтным канфакальным мікраскопе MT200 з часовым дазволам (Pico-Quant, Берлін, Германія), які выкарыстоўваўся для эксперыментаў па мікраскапіі FLIM-FRET з выкарыстаннем рэжыму PIE.Магутнасць лазера для гэтых эксперыментаў была дададзена да 6,0 мкВт (481 нм) і 6,2 мкВт (637 нм).Камбінацыя гэтых магутнасцей лазера была выбрана для атрымання аднолькавай яркасці для пар флюарафораў, якія выкарыстоўваюцца пры дасягненні аптымальнай хуткасці падліку і пазбяганні фотаадбельвання і насычэння.Збор і аналіз дадзеных праводзіліся з выкарыстаннем камерцыйна даступнага праграмнага забеспячэння SymphoTime64 версіі 2.3 (PicoQuant, Берлін, Германія).
Узоры ізаляваных агрэгатаў αS/Tau, атрыманых з выкарыстаннем LLPS, разводзяць у ізаляцыйным буферы да адпаведнай монамалекулярнай канцэнтрацыі (як правіла, у развядзенні 1:500, паколькі агрэгаты ўжо маюць нізкія канцэнтрацыі пры вылучэнні з узораў каацэрвату).Узоры наносіліся непасрэдна на покрыўныя шкла (Corning, ЗША), папярэдне пакрытыя растворам БСА ў канцэнтрацыі 1 мг/мл.
Для аналізу PIE-smFRET у зялёным і чырвоным каналах быў ужыты больш нізкі парог інтэнсіўнасці ў 25 фатонаў, каб адфільтраваць сігналы нізкай інтэнсіўнасці, выкліканыя манамернымі падзеямі (звярніце ўвагу, што колькасць манамераў перавышае колькасць агрэгаваных узораў у параўнанні з ізаляванымі агрэгатамі).Гэты парог быў разлічаны як пяціразовая сярэдняя інтэнсіўнасць манамернага αS, атрыманага ў выніку аналізу чыстых узораў манамераў, каб спецыяльна выбраць агрэгаты для аналізу.Схема прывада PIE разам са зборам даных TSCPC дазволіла прымяніць фільтр узважвання на працягу ўсяго жыцця, які дапамагае ліквідаваць фонавыя і спектральныя перакрыжаваныя перашкоды.Інтэнсіўнасць успышкі, абраная з выкарыстаннем прыведзеных вышэй парогаў, была скарэкціравана з дапамогай сярэдняга фонавага сігналу, вызначанага з гістаграм узнікнення ў залежнасці ад інтэнсіўнасці/біну ўзораў толькі з буферам.Усплёскі, звязаныя з буйнымі агрэгатамі, звычайна займаюць некалькі паслядоўных бункераў на трасіроўцы часу (усталявана на 1 мс).У гэтых выпадках выбіраўся бункер максімальнай трываласці.Для FRET і стэхіаметрычнага аналізу выкарыстоўваўся тэарэтычна вызначаны гама-каэфіцыент γ (0,517).Спектральныя крыжаваныя перашкоды і ўклады прамога ўзбуджэння нязначныя (вызначаюцца эксперыментальна) пры выкарыстоўванай магутнасці ўзбуджальнага лазера.Эфектыўнасць і стэхіаметрыя FRET пры выбуху разлічваецца наступным чынам.