Хімічны кампанент спіральнай трубы з нержавеючай сталі 347, ідэнтыфікацыя новых бялкоў-шаперонаў, якія рэагуюць на інтэрферон, чалавечага лейкацытарнага антыгена-А (HLA-A) з дапамогай сшытай мас-спектраметрыі (CLMS)

Дзякуй за наведванне Nature.com.Вы выкарыстоўваеце версію браўзера з абмежаванай падтрымкай CSS.Для найлепшага вопыту мы рэкамендуем вам выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer).Акрамя таго, каб забяспечыць пастаянную падтрымку, мы паказваем сайт без стыляў і JavaScript.
Паўзункі, якія паказваюць тры артыкулы на слайдзе.Для перамяшчэння па слайдах выкарыстоўвайце кнопкі "Назад" і "Далей" або кнопкі кантролера слайдаў у канцы для перамяшчэння па кожным слайдзе.

Апісанне Прадукта

Змеявікі з нержавеючай сталі 347L, Марка сталі: SS347L

Сігнальная сістэма інтэрферону індукуе моцную цітокіны адказ на шырокі спектр патагенных і ўнутраных паталагічных сігналаў з навакольнага асяроддзя, што прыводзіць да індукцыі падгрупы інтэрферон-індукаваных бялкоў.Мы ўжылі DSS-апасродкаванай мас-спектраметрыі папярочнай сувязі (CLMS) для выяўлення новых узаемадзеянняў бялок-бялок у вобласці інтэрферон-індукаваных бялкоў.У дадатак да чаканых бялкоў, індукаваных інтэрферонам, мы таксама вызначылі новыя міжмалекулярныя і ўнутрымалекулярныя сшытыя аддукты кананічных бялкоў, індукаваных інтэрферонам, такіх як MX1, USP18, OAS3 і STAT1.Мы засяродзіліся на артаганальнай праверцы новага набору індуцыраваных інтэрферонам бялковых сетак, утвораных вавёркамі HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) з выкарыстаннем сумеснай імунапрэцыпітацыі і іх далейшым вывучэнні з дапамогай мадэлявання малекулярнай дынамікі.Мадэляванне канфармацыйнай дынамікі бялковага комплексу выявіла некалькі сайтаў узаемадзеяння, якія адлюстроўваюць узаемадзеянні, выяўленыя ў высновах CLMS.Разам мы прадстаўляем пілотнае даследаванне CLMS для ідэнтыфікацыі новых сігнальных комплексаў, выкліканых інтэрферонам, і з нецярпеннем чакаем больш шырокага выкарыстання CLMS для выяўлення новай дынамікі ўзаемадзеяння бялкоў у мікраасяроддзі пухліны.
Перш чым пачнецца адаптыўны імунны адказ, сістэма прыроджанай абароны гаспадара стварае антымікробны адказ, апасродкаваны сямействам сакрэтаваных альфа-спіральных цітокінаў, якія называюцца інтэрферонамі (IFN).Класы IFN тыпу I IFNα і IFNβ актывуюць клеткавыя рэакцыі, уключаючы супрацьвірусныя, проапоптозные, провоспалительные і антипролиферативные стану.У людзей вядома 13 падтыпаў IFNα, усе згрупаваныя ў храмасоме 91. Дзіўна, але толькі IFNα2 быў вывучаны для клінічнага выкарыстання.У апошні час асаблівая ўвага надаецца даследаванням іншых падтыпаў IFNα.Нядаўняе даследаванне паказала, што IFNα14 з'яўляецца адной з найбольш эфектыўных ізаформ у абмежаванні рэплікацыі HBV2 і ВІЧ-13,4 у параўнанні з кананічным падтыпам IFNα2.
Устаноўлена, што актываваныя рэцэптарныя комплексы інтэрферону I тыпу (IFNAR1 і IFNAR2) запускаюць каскад перадачы сігналу, апасродкаваны янус-киназами TYK2 і JAK15,6.Гэтыя Янус-киназы фасфарылююць сігнальныя пераўтваральнікі і актыватары транскрыпцыйных бялкоў (STAT1 і STAT2) на рэштках тыразіну, каб ініцыяваць апасродкаваную даменам SH2 гетэрадымерызацыю6.У далейшым IRF9 звязвае гетэрадымеры STAT з адукацыяй трымернага комплексу гена фактару 3, стымуляванага ІФН (ISGF3), які перамяшчаецца ў ядро ​​і індукуе транскрыпцыю больш чым 2000 генаў, стымуляваных інтэрферонам (ISG)5,6,7,8.
У якасці першай лініі абароны ад віруснай інфекцыі клеткі хутка разгортваюць шырокае ўзаемадзеянне клеткавых бялкоў з шырокім спектрам біялагічнай актыўнасці.Гэтыя вавёркі ўключаюць рэцэптары распазнавання вобразаў, сігнальныя малекулы, фактары транскрыпцыі і вавёркі з прамымі супрацьвіруснымі функцыямі, а таксама негатыўныя рэгулятары імунных рэакцый9.Большая частка інфармацыі аб актыўнасці ISG паступае з функцыянальных экранаў з выкарыстаннем экранаў празмернай экспрэсіі 10, 11 або метадаў глушэння генаў (siRNA, RNAi і CRISPR) 12, 13, у якіх асобныя ISG экспрэсуюць або інгібіруюць, і іх актыўнасць тэстуецца на розных вірусах.Хоць гэтыя даследаванні вызначылі супрацьвірусныя ўласцівасці асобных ISG, малекулярныя механізмы, якія ляжаць у аснове кожнага ISG, застаюцца ў значнай ступені невядомымі.Агульнапрызнана, што многія вавёркі ўзаемадзейнічаюць з адным або некалькімі цітокінамі для забеспячэння поўнай актыўнасці, таму альбо ISG ўзаемадзейнічаюць непасрэдна, альбо іх узаемадзеянне апасродкавана клеткавымі вавёркамі.Напрыклад, нядаўняе даследаванне фотасшытай пратэёмікі ідэнтыфікавала ATPase VCP/p97 як галоўнага партнёра па ўзаемадзеянні IFITM3, інгібіраванне якога прыводзіць да дэфектаў у лізасомальнай сартаванні, абароце і сумеснай транспарце IFITM3 з віруснымі часціцамі 14 .Выкарыстоўваючы імунапрэцыпітацыю, мы вызначылі VAPA, бялок, звязаны з бурбалкамі, у якасці партнёра па ўзаемадзеянні з IFITM1/2/3, які апасродкуе паспяванне віруса, апасродкаванае халестэрынам, і гэта было пацверджана іншым даследаваннем з выкарыстаннем двухгібрыднай сістэмы дрожджаў.Навуковае забеспячэнне 15 , 16 .
Фундаментальным біялагічным працэсам, які ўдзельнічае ў падаўленні інфекцыі і злаякаснай трансфармацыі, з'яўляецца прэзентацыя антыгена, якая апасродкавана малекуламі галоўнага комплексу гистосовместимости (МНС).Пептыды (даўжынёй 8-12 амінакіслот) з расшчапленых, заўчасна спыненых або няправільна згорнутых бялкоў загружаюцца ў гетэрадымер MHC-I (які складаецца з цяжкіх і лёгкіх ланцугоў MHC-I, які называецца β-2-мікраглабулін; β2M) 17,18.Атрыманыя ў выніку стабільныя трымеры MHC-I транспартуюцца на паверхню клеткі, дзе яны прадстаўляюць унутрыклеткавыя пептыды CD8+ Т-клеткам (цітотоксіческой Т-клеткам)17.
Гены, якія ўдзельнічаюць у рэакцыі на патагены, павінны хутка пераключацца паміж станам спакою і станам актыўнай транскрыпцыі.Такім чынам, мяркуецца, што некалькі клеткавых бялкоў удзельнічаюць у адказе на высокую патрэбу ў IFN на працягу кароткіх перыядаў часу, уключаючы рэканструкцыю і мадыфікацыю промоторного храмаціну 20,21.Большасць даследаванняў сканцэнтравана на ідэнтыфікацыі асобных бялковых партнёраў ISG у прысутнасці IFN.Аднак, нягледзячы на ​​ўсё большае разуменне дынамікі, выкліканай інтэрферонамі, мы ўсё яшчэ мала ведаем аб удзеле ISG.Калі разглядаць складанасць і залежную ад часу дынаміку перадачы сігналаў інтэрферону, узнікаюць два пытанні: (I) ці можна стабілізаваць і ўлоўліваць мультибелковые комплексы, якія ўдзельнічаюць у хуткай перадачы сігналаў, і (II) ці можна адлюстраваць гэтыя ўзаемадзеяння ў трохмернай прасторы?
Каб вырашыць гэтыя праблемы, мы ўкаранілі апасродкаванае дысукцынімідам хімічнае перакрыжаванае сшыванне (DSS) у спалучэнні з мас-спектраметрыяй (CLMS) для вывучэння сеткі ўзаемадзеяння бялкоў, выкліканай IFNα, і яе дынамікі.Наступны аналіз MS выяўляе спецыфічныя сайты сшывання, якія адлюстроўваюць прасторавую блізкасць абласцей у канкрэтным бялку, якія называюцца ўнутранымі сувязямі, або субадзінак у бялковых комплексах, якія называюцца ўзаемасувязямі.Шляхам далейшага тэсціравання падмноства гэтых новых узаемадзеянняў мы дэманструем, што H2BFS (H2B гистонового тыпу FS; у далейшым H2B) і MDN1 дзейнічаюць як партнёры па звязванні для HLA-A.
Аднак не ўсе пухліны з'яўляюцца імунагеннымі, і каб вызначыць, ці рэагуюць клеткі Flo-1 на лячэнне інтэрферонам, мы апрацоўвалі клеткі Flo-1 10 НГ/мл IFNα на працягу 72 гадзін.Клеткі Flo-1 паказалі раннюю індукцыю pSTAT1 і IRF1, пачынаючы праз 2 гадзіны пасля лячэння і працягваючы на ​​працягу 72 гадзін, з залежным ад часу зніжэннем стацыянарных узроўняў IRF1 (малюнак 1A).ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2 і ISG15) апынуліся моцна індукаванымі праз 6 гадзін, імітуючы класічныя рэакцыі сярэдняй і позняй фаз на IFNα (малюнак 1А).
(А) Экспрэсію бялку ў клетках Flo-1, апрацаваных 10 НГ/мл IFNα на працягу 2, 6, 24, 48 і 72 гадзін, аналізавалі імунаблотам з выкарыстаннем паказаных антыцелаў ISG.(C) Рэпрэзентатыўны иммуноблот, даследаваны з антыцеламі p53(DO-1) з тых жа узораў, каб ацаніць ступень сшывання бялку.
Каб захапіць ландшафт ўзаемадзеяння бялку in situ, мы выкарыстоўвалі DSS, шырока выкарыстоўваны сшываючы агент з-за яго высокай пранікальнасці мембраны і адносна кароткага часу рэакцыі.Больш кароткі час рэакцыі дапамагае прадухіліць адукацыю вялікіх агрэгатаў сшытых бялкоў, тым самым падтрымліваючы стабільнасць сшывальнага агента.Каб вызначыць аптымальную канцэнтрацыю DSS і пазбегнуць празмернай сшыўкі, мы спачатку падверглі клеткі ўздзеянню 5, 2,5 і 1 мм DSS на працягу 5, 10, 5 і 30 хвілін адпаведна і прааналізавалі лізаты з дапамогай SDS-PAGE, афарбаванага Кумасі. (дадзеныя не паказаны) .Клеткавыя лізаты аказваюцца моцна сшытымі пры самай нізкай канцэнтрацыі і ў самы кароткі час.Такім чынам, DSS тытравалі да 1, 0,5 і 0,1 ммоль на працягу 5 хвілін (малюнак 1B).Аптымальнае сшыванне назіралася з 0,5 мМ DSS на працягу 5 хвілін, і гэтыя ўмовы былі выбраны для клетак, апрацаваных IFNα.Акрамя таго, на малюнку 1C паказаны Вестэрн-блот, выкананы з выкарыстаннем антыцелаў p53 (DO-1) для ацэнкі ступені сшывання бялку.
Затым спектры МС/МС супастаўляюцца з паслядоўнасцю бялку і вызначаюцца колькасна з дапамогай MaxQuant26,27.Сшытыя пептыды былі ідэнтыфікаваныя з атрыманых спектраў з дапамогай праграмы SIM-XL, і асобныя злучэнні былі аб'яднаны ў складаную сетку з дапамогай канвеераў вылічальнага праграмнага забеспячэння xQuest28 і SIM-XL29 з адкрытым зыходным кодам (мал. 2).SIM-XL ідэнтыфікуе бялкова-бялковыя ўзаемадзеянні, унутраныя ланцугі і асобныя ланцугі ў простых або складаных бялковых сумесях і забяспечвае сцэнарыі для візуалізацыі ўзаемадзеяння ў бялковых структурах.Акрамя таго, ён ранжыруе кожную перакрыжаваную спасылку як ідэнтыфікацыйны бал у адпаведнасці з якасцю спектру MS/MS29.Было выяўлена некалькі вельмі надзейных бялкова-бялковых узаемадзеянняў і комплексаў, і новы набор узаемадзеянняў быў дадаткова даследаваны з выкарыстаннем сумеснай імунапрэцыпітацыі і канфармацыйных змен комплексаў з выкарыстаннем малекулярна-дынамічнага (MD) мадэлявання (мал. 2) 30, 31.
Схематычны агляд метаду CLMS.Клеткі Flo-1 апрацоўвалі 10 нг/мл IFNα на працягу 24 гадзін з наступным сшываннем бялку in situ з выкарыстаннем DSS з наступным лізісам клетак і трыпсінізацыяй.Сшытыя ўзоры аналізавалі з дапамогай мас-спектрометра Orbitrap і дадаткова адбіралі пробы на фрагментацыю папярэднікаў пептыдаў падчас ВХ-МС/МС.Два звязаных пептыда былі ідэнтыфікаваныя з атрыманых спектраў з дапамогай Spectrum Recognition Machine праграмы Crosslinked Peptides (SIM-XL), і ўсе злучэнні былі аб'яднаны ў складаную сетку з дапамогай вылічальных канвеераў.Адфільтраваць узаемадзеянне з нізкім узроўнем даверу на аснове паказчыкаў ілжывых станоўчых вынікаў (FDR).Некалькі новых высокадакладных узаемадзеянняў бялок-бялок былі дадаткова пацверджаны з дапамогай сумеснай імунапрэцыпітацыі, а канфармацыйныя змены ў комплексах былі даследаваны з дапамогай мадэлявання малекулярнай дынамікі (MD).
У агульнай складанасці ~30 500 і ~ 28 500 пептыдаў былі выяўлены з дапамогай MaxQuant у нестимулированных і стымуляваных узорах IFNα адпаведна (дадатковая табліца S1, мал. 3A).Размеркаванне пептыдаў па даўжыні ў абодвух выпадках паказала больш высокую долю больш буйных пептыдаў, што сведчыць аб наяўнасці сшытых пептыдаў (мал. 3B, C).Акрамя таго, большая доля больш буйных пептыдаў прысутнічала ў дыяпазоне 40-55 ва ўзорах, апрацаваных IFNα (мал. 3C).Карціраванне бялкоў у параўнанні з інтэнсіўнасцю log2 паказала, што класічныя бялкі, стымуляваныя інтэрферонам, былі найбольш распаўсюджанымі ў параўнанні з неапрацаванымі ўзорамі, уключаючы MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 і HLA-F (малюнак 3D).Аналіз шляхоў больш чым трохразовага ўзбагачэння бялкоў у адказ на лячэнне IFNα з выкарыстаннем базы дадзеных шляхоў Reactome паказаў, што апасродкаваная MHC-I прэзентацыя і працэсінг антыгена былі найбольш дамінуючым шляхам (малюнак 3E).У адпаведнасці з папярэднімі паведамленнямі, супрацьвірусныя рэакцыі, апасродкаваныя OAS і ISG15, а таксама IFNα/β і перадачай сігналу цітокіны, былі аднымі з актываваных шляхоў.Акрамя таго, лізін- і серын-спецыфічныя бялковыя папярочныя сувязі былі ідэнтыфікаваныя з першапачаткова атрыманых MS / MS спектраў з дапамогай SIM-XL.Нядаўняе даследаванне паведаміла пра 104 ISG, якія ахопліваюць 20 вірусаў з 9 класаў вірусаў, шляхам метааналізу асобных даследаванняў гіперэкспрэсіі ISG у 5 тыпах клетак9.Аднак, каб пераадолець вылічальныя абмежаванні скрынінга вялікіх набораў даных, мы пачалі з меншага набору даных, каб вывучыць магчымыя ўзаемадзеянні паміж спісам генаў IRDS, пра якія паведамляюць Падарыя і інш., большасць з якіх з'яўляюцца ISG.
Ідэнтыфікацыя дыферэнцыяльна экспрэсіраваных сшытых бялкоў у адказ на IFNα (дадзеныя атрыманы ад MaxQuant).(A) Дыяграма Венна, якая паказвае колькасць звычайных і эксклюзіўных пептыдаў, выяўленых у апрацаваных і неапрацаваных IFNα14 узорах Flo-1.Размеркаванне пептыдаў па даўжыні неапрацаваных (B) і апрацаваных IFNα (C) сшытых узораў.(D) Цеплавая карта, якая прадстаўляе log2 (інтэнсіўнасць LFQ) паміж неапрацаванымі і апрацаванымі IFNα14 клеткамі Flo-1.На левай панэлі паказаны вавёркі, найбольш актыўна актываваныя ў прысутнасці IFNα.(E) Гістаграма, якая прадстаўляе 20 асноўных шляхоў узбагачэння пасля лячэння IFNα.База дадзеных шляху Reactome прааналізавала больш чым чатырохразовыя змены ў рэгуляваных бялках, якія рэагуюць на IFNα.
Стымуляцыя ISG, апасродкаваная інтэрферонам, добра дакументавана, але на малекулярным узроўні недастаткова зразумела, як гэтыя вавёркі выконваюць шырокі спектр біялагічных функцый.Мы даследавалі бялковыя ўзаемадзеяння з высокай ступенню ўпэўненасці паміж вядомымі ISG.Цікава, што мы вызначылі сетку, якая ўключае бялкі MX1, USP18, ROBO1, OAS3 і STAT1, якія ўтвараюць вялікі комплекс у адказ на лячэнне IFNα (малюнак 4, табліца S2) 32,33,34.Самае галоўнае, што гэтыя ўзаемадзеянні былі выяўленыя ва ўсіх трох копіях, апрацаваных IFNα, і не былі знойдзены ў неапрацаваных узорах, што сведчыць аб тым, што яны ўтварыліся спецыяльна ў адказ на лячэнне IFNα.Вядома, што STAT1 транскрыпцыйна рэгулюе экспрэсію гэтых ISG, але яго ўзаемадзеянне з ISG на бялковым узроўні не вывучана.Крышталічная структура STAT1 паказала, што яго спіральны дамен (CCD) не ўдзельнічае ва ўзаемадзеянні з ДНК або пратамерамі падчас адукацыі дымераў35.Гэтыя α-спіралі ўтвараюць спіральную структуру спіралі, якая забяспечвае пераважна гідрафільную паверхню для ўзаемадзеяння 35 .У нашых дадзеных CLMS мы заўважылі, што большасць узаемадзеянняў са STAT1 адбывалася ў дамене SH2, які папярэднічае CCD, дамену лінкера або C-канцавым хвасце (рэшткі 700-708) (мал. 4A).Папярэдняе даследаванне паказала, што USP18 звязваецца з CCD і ДНК-звязваючым даменам (DBD) STAT2 і прыцягваецца да субадзінак рэцэптара інтэрферону тыпу I IFNAR2, каб апасродкаваць інгібіраванне перадачы сігналаў інтэрферону тыпу I 24 .Нашы дадзеныя таксама паказалі, што каталітычны дамен USP18 узаемадзейнічае з STAT1 DBD (малюнак 4A, D), мяркуючы, што і STAT1, і STAT2 могуць гуляць пэўную ролю ў прыцягненні USP18 да IFNAR2.
Бялкова-бялковая сетка ISG, ідэнтыфікаваная ў пашытых клетках, апрацаваных IFNα.(A) Двухмерны графік узаемадзеяння, які паказвае ўзаемадзеянне бялок-бялок (генеруецца ў праграме SIM-XL), з лініямі, якія прадстаўляюць міжмалекулярныя ўзаемадзеянні (межавая адзнака сшывання 3,5).Дамен ROBO1, Ig_3 (67–151), I-набор (170–258), I-набор (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) і fn3 (777–864).Палі STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) і STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Кругавы аглядальнік сшытых бялкоў (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 і STAT1) з узаемадзеяннямі і ўзаемадзеяннямі, пазначанымі сінім і чырвоным адпаведна.Парог крыжаванай сувязі быў усталяваны на 3,5.Кропкавыя графікі паказваюць сайты ўзаемадзеяння STAT1 з MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) і OAS3 (F), а таксама сайты ўзаемадзеяння K або S паміж двума пептыдамі.На малюнку парог ацэнкі перакрыжаванай сувязі ўстаноўлены на 3,0.(G) Розныя сайты ўзаемадзеяння паміж STAT1 і OAS3 DI даменамі, накладзенымі на іх бялковыя структуры ў PyMol (сістэма малекулярнай графікі PyMOL, версія 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (ідэнтыфікатар PDB: 1bf533) і OAS3 (ID PDB: 4s3n34).) праграма.
Дзве ізаформы USP18 былі апісаны ў людзей, бялок поўнай даўжыні, які пераважна размешчаны ў ядры, і ізаформа без N-канцавога дамена, USP18-sf, які раўнамерна размеркаваны ў цытаплазме і ядры 36 .Акрамя таго, было прадказана, што N-канец будзе неструктураваным і не патрабуе актыўнасці изопептидазы або звязвання ISG1537.Большасць узаемадзеянняў, выяўленых у нашым даследаванні, былі размешчаны на N-канцы бялку, што сведчыць аб тым, што гэтыя ўзаемадзеянні ўключаюць поўнаметражны USP18 (малюнак 4A, D) і, такім чынам, верагодна, адбываюцца ў ядры.Сайт звязвання IFNAR2 размешчаны паміж рэшткамі 312-368, і, асабліва, ні адзін з бялкоў у комплексе не звязваецца з гэтай вобласцю (мал. 4А) 37,38.
ROBO1 належыць да суперсямейства імунаглабулінаў (Ig) трансмембранных сігнальных малекул і складаецца з пяці даменаў Ig і трох даменаў фібранектыну (Fn) ва пазаклеткавай вобласці.Пасля гэтых пазаклеткавых даменаў ідуць праксімальная вобласць мембраны і адзіная трансмембранная спіраль 39. Неструктураваная ўнутрыклеткавая вобласць размешчана на С-канцы і змяшчае кансерватыўныя матывы паслядоўнасці, якія апасродкуюць звязванне эфектарнага бялку 39.Вобласць ад ~1100 да 1600 амінакіслот у асноўным неўпарадкаваная.Мы выявілі, што MX1 ўзаемадзейнічае з ROBO1 праз Ig, Fn і ўнутрыклеткавых даменаў, у той час як большасць узаемадзеянняў з STAT1 адбываецца паміж яго CCD, линкерным даменам і С-канцом ROBO1 (мал. 4A, E).З іншага боку, узаемадзеянне з DI, DIII і OAS3 линкерных абласцей былі размеркаваны па ўсім бялку ROBO1 (мал. 4A).
Сямейства бялкоў алігаадэнілатсінтазы (OAS) прымае і звязвае ўнутрыклеткавую двухцепочечную РНК (dsRNA), падвяргаецца канфармацыйным зменам і сінтэзуе 2',5'-звязаныя алігаадэнілаты (2-5 As) 40 .Было выяўлена, што сярод трох OAS OAS3 праяўляе найбольшае сродство да dsRNA і сінтэзуе найменшую колькасць 2-5 As, які можа актываваць РНКазу L і тым самым абмежаваць рэплікацыю віруса 41 .Папярэднія даследаванні паказалі, што каталітычная актыўнасць C-канцавога дамена (DIII) залежыць ад dsRNA-звязвае дамена (DI), які неабходны для актывацыі OAS342.Мы заўважылі, што дамены DI і DII ​​OAS3 ўзаемадзейнічаюць з CCD і невялікай вобласцю злучэння паміж SH2 і STAT1 TAD (малюнак 4A, F).Накладанне розных сайтаў сшывання на структуру бялку паказала ўзаемадзеянне паміж β-лістом і пятлёй DBD STAT1 і адкрытай кішэняй або паражніной, утворанай рэшткамі 60-75 у дамене DI OAS3 (мал. 4G).Арыентацыя бялкоў у комплексе таксама паказала, што ні адно з узаемадзеянняў з OAS3 не перашкаджала ДНК-звязваючай здольнасці яго DI-дамена (мал. S1A).Акрамя таго, N-канцавы дамен GTPase MX1 актыўна ўзаемадзейнічае з DI і DIII даменамі OAS3 (мал. 4A).Мы таксама назіралі ўзаемадзеянне паміж OAS1 і MX1 ва ўсіх трох паўторах, апрацаваных IFNα, дзе адзін дамен OAS1 (таксама каталітычна актыўны) узаемадзейнічаў з усімі трыма даменамі MX1 (малюнак S2A,B).
Вавёркі МХ з'яўляюцца часткай вялікага сямейства дынеінападобных ГТФаз, якія ўтрымліваюць N-канцавы дамен ГТФазы, які звязвае і гідралізуе ГТФ, прамежкавы дамен, які апасродкуе самазборку, і С-канцавую лейцынавую маланку, якая дзейнічае як ГТФаза (LZ ).эфектарны дамен25,43.MX1 звязваецца з субадзінак віруснай палімеразы, каб блакаваць транскрыпцыю віруснага гена43.Двухгібрыдны аналіз дрожджаў, пра які паведамлялася раней, паказаў, што MX1, звязаны з PIAS1, інгібіруе апасродкаваную STAT1 актывацыю гена, блакуючы ДНК-звязвальную актыўнасць, а таксама валодае актыўнасцю лігазы SUMO E344,45.Тут мы дэманструем, што MX1 звязваецца са STAT1 (малюнак 4C, D), аднак тое, як гэта ўзаемадзеянне ўплывае на апасродкаваную STAT1 актывацыю гена ў адказ на IFNα, патрабуе далейшага вывучэння.Акрамя таго, мы таксама выявілі, што MX1 ўзаемадзейнічаў з IFIT3 і DDX60 ва ўсіх трох апрацаваных IFNα паўторах (мал. S2C).
DDX60 - гэта цытаплазматычная геліказа, выкліканая IFN, якая, як паведамлялася, гуляе ролю ў незалежнай ад RIG-I дэградацыі віруснай РНК46.Ён узаемадзейнічае з RIG-I і актывуе яго перадачу сігналаў спецыфічным для ліганда спосабам 46. DDX60 складаецца з геліказнага дамена DEXD/H-Box і С-канцавога геліказнага дамена, якія звязваюць вірусную РНК і ДНК47.Большасць яго ўзаемадзеяння з MX1 і IFIT3 адбываюцца ў доўгіх N- і C-канцавых абласцях без кананічных даменаў або матываў (мал. S2E, F).Аднак MX1 таксама звязаны з геликазным даменам DEXD/H-Box (мал. S2E).Вавёркі сямейства IFIT маюць тандэмныя копіі адметнага матыву спіраль-паварот-спіраль, які называецца тэтрапептыдным паўторам (TPR).Было выяўлена, што IFIT3 з'яўляецца станоўчым мадулятарам сігналізацыі RIG-I і, такім чынам, з'яўляецца кампанентам комплексу MAVS.У сукупнасці нашы дадзеныя паказваюць, што IFIT3 і DDX60 ўзаемадзейнічаюць у асноўным у вобласці паміж TPR 3-6 IFIT3 і могуць гуляць пэўную ролю ў перадачы сігналаў RIG-I/MAVS (мал. S2F).
Улічваючы, што скрынінг усяго пратэома з'яўляецца інтэнсіўным вылічальным спосабам, мы затым праверылі ўсю базу дадзеных UniProt чалавека на наяўнасць аднаго з паўтораў, апрацаваных IFNα.У гэтай копіі мы знайшлі некалькі вельмі надзейных сетак узаемадзеяння для HLA-A.Аналіз бялковых шляхоў, ідэнтыфікаваных спектрамі MS/MS, паказаў, што апрацоўка і прэзентацыя антыгена на аснове MHC-I з'яўляецца асноўным шляхам, індукаваным інтэрферонам (мал. 3D).Такім чынам, мы засяродзіліся на вывучэнні бялковых узаемадзеянняў малекул MHC-I з высокай ступенню ўпэўненасці ва ўсіх сшытых узорах.HLA складаецца з даменаў α1, α2 і α3 і лёгкіх ланцугоў, а мікраглабулін β2 (β2m) з'яўляецца пастаянным бялком-шаперонам49.Пасля зборкі ў эндаплазматычнай сетцы HLA нестабільны ў адсутнасць пептыдных лигандов50.Баразёнка, якая звязвае пептыд, утворана вельмі паліморфнымі і неструктураванымі даменамі α1 і α2 у непептыднай форме і адносна менш паліморфным даменам α351.У прысутнасці IFNα мы выявілі два комплексы HLA-A: адзін узаемадзейнічае з HMGA1 і H2B (малюнак 5, табліца S3), а другі ўзаемадзейнічае з MDN1, LRCH4 і H2B (малюнак 6).
IFNα індукуе сетку ўзаемадзеяння HLA-A з H2B (H2BFS) і HMGA1.(A) Двухмерны графік (створаны ў праграмным забеспячэнні SIM-XL), які адлюстроўвае розныя тыпы ўзаемадзеянняў у комплексе H2B-HLA-A-HMGA1: міжсувязь (сіні), міжсувязь (чырвоны) і адзінкавая сувязь (чорны)..Дамены рознай ідэнтычнасці пазначаны колерам32: H2B (гістон; 2–102) і MHC-I (MHC_1; 25–203, група C1; 210–290 і MHC_I_C; 337–364).Парог крыжаванай сувязі быў усталяваны на 3,5.Кропкавыя графікі паказваюць сайты ўзаемадзеяння HLA-A з H2B (B) і HMGA1 (C), а таксама месцы ўзаемадзеяння K або S паміж двума пептыдамі.На малюнку парог ацэнкі перакрыжаванай сувязі ўстаноўлены на 3,0.(D) Адносіны паміж вавёркамі, паказанымі ў структурах бялкоў H2B, HLA-A і HMGA1 у праграме PyMOL.Гэтыя структуры былі змадэляваныя з дапамогай сервера Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2), а шаблонныя структуры для бялкоў H2B, HLA-A і HMGA1 былі 1kx552, 1kj349 і 2eze55 адпаведна.
IFNα індукуе сетку ўзаемадзеяння HLA-A з H2B (H2BFS), MDN1 і LRCH4.(А) Унутрымалекулярныя (чырвоны) і міжмалекулярныя (сіні) сшыўкі, прадстаўленыя на 2D інтэрактыўнай карце (створанай у праграмным забеспячэнні SIM-XL) з MDN1, прадстаўленым у выглядзе круга.Парог крыжаванай сувязі быў усталяваны на 3,5.Дамены рознай ідэнтычнасці пазначаны колерам32: H2B (гістон; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, група C1; 210–290 і MHC_I_C; 337–364) і LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) і CH (535–641)).(B) Адносіны паміж вавёркамі, паказанымі ў структурах бялкоў H2B, HLA-A, LRCH4 і MDN1 у праграме PyMOL.Гэтыя структуры былі змадэляваны з дапамогай сервера Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) з шаблоннымі структурамі 1kx552, 1kj349, 6hlu62 і 6i2665 для бялкоў H2B, HLA-A, LRCH4 і MDN1, адпаведна.Кропкавыя графікі, якія паказваюць сайты ўзаемадзеяння K або S для HLA-A з H2B (C), LRCH4 (D) і MDN1 (E).Для участкаў парог ацэнкі крыжаванай сувязі быў усталяваны на 3,0.
Акрамя падтрымання цэласнасці геному, гістон H2B таксама ўдзельнічае ў рэгуляцыі транскрыпцыі.Бялок H2B складаецца з цэнтральнага гістонавага дамена (HFD), утворанага трыма α-спіралямі, падзеленымі завесамі, і С-канцавым хвастом 41,52.Большая частка ўзаемадзеяння з H2B адбываецца ў спіралі α1, якая забяспечвае тримеризацию з гетеродимером HFD (мал. 5A, B).Хоць лізіны ўдзельнічаюць у звязванні ДНК, некаторыя лізіны таксама з'яўляюцца альтэрнатыўнымі месцамі ацэтылявання або метылявання.Напрыклад, рэшткі K43, K46 і K57 з H2B не ўдзельнічаюць у прамым звязванні ДНК, але з'яўляюцца мішэнямі розных посттранскрипционных мадыфікацый53.Аналагічным чынам рэшткі K44, K47 і K57 у H2B могуць гуляць альтэрнатыўную ролю ў прысутнасці IFNα, уключаючы ўзаемадзеянне з іншымі вавёркамі (мал. 5A, B).Акрамя таго, экстрахрамасомны гістон H2B актывуе імунны адказ у розных тыпах клетак, дзейнічаючы як цытазольны датчык для выяўлення фрагментаў двухцепочечной ДНК (dsDNA), атрыманых з інфекцыйных агентаў або пашкоджаных клетак54.У прысутнасці ДНК-вірусаў знясіленне H2B інгібіравала выпрацоўку IFN-β і фасфараляванне STAT154.Таксама вядома, што H2B рухаецца ў ядро ​​і выходзіць з яго хутчэй, чым іншыя асноўныя гістоны54.Узаемадзеянне H2B з MDN1 і LRCH4 таксама назіралася ў асобных неапрацаваных узорах.Мы выявілі, што HLA-A ўзаемадзейнічае з H2B ва ўсіх трох узорах, апрацаваных IFNα, і ў адным неапрацаваным паўторным узоры.
HMGA1 (група высокай мабільнасці AT-Hook 1), невялікі нуклеапратэін, багаты амінакіслотамі, якія спрыяюць хваробе, быў ідэнтыфікаваны ў сувязі з HLA-A.Ён мае кіслы С-канцавы хвост і тры розныя DBD, званыя AT-гаплікамі, таму што яны звязваюцца з малой баразёнкай AT-багатай вобласці ў dsDNA55,56.Гэта звязванне прымушае ДНК згінацца або выпроствацца, дазваляючы кананічным фактарам транскрыпцыі атрымаць доступ да яе кансенсуснай паслядоўнасці.Мяркуецца, што С-канцавы хвост удзельнічае ў бялкова-бялковых узаемадзеяннях і вярбоўцы транскрыпцыйных фактараў, паколькі С-канцавыя дэлецыйныя мутанты не здольныя ініцыяваць транскрыпцыю57.Больш за тое, гэты дамен змяшчае некалькі кансерватыўных сайтаў фасфаралявання, якія з'яўляюцца вядомымі субстратамі для кіназ 58 .Мы назіралі ўзаемадзеянне HLA-A і H2B з HMGA1 за межамі C-канцавога дамена, мяркуючы, што C-канцавы дамен у асноўным выкарыстоўваецца для звязвання фактару транскрыпцыі (мал. 5A, C).Вавёркі HMGA канкуруюць з гістонам H1 за звязванне з адаптарнай ДНК, тым самым павялічваючы даступнасць57.Падобным чынам здаецца верагодным, што HMGA ўзаемадзейнічае з гістонам H2B уздоўж лінкернай ДНК у канкурэнцыі з гістонам H1.HMGB1 індукуе экспрэсію HLA-A, -B і -C у дендрітных клетках, што прыводзіць да іх актывацыі59, але пра ўзаемадзеянне паміж HMG і HLA раней не паведамлялася.У нашых руках было ўстаноўлена, што HLA-A лакалізаваны ў ядры (дадзеныя не паказаны), і, улічваючы, што H2B і HMGA1 таксама прысутнічаюць у ядры, гэта ўзаемадзеянне, верагодна, адбываецца ў ядры.
Большасць узаемадзеянняў HLA-A з іншымі вавёркамі адбываецца ў яго даменах α1 і α2 і неўпарадкаваным С-канцавым дамене (мал. 6).У адным з гэтых прыкладаў мы выявілі, што HLA-A ўзаемадзейнічае з неўпарадкаваным N-канцавым хвастом LRCH4 (малюнак 6A, D).LRCH4 рэгулюе актывацыю TLR4 і індукцыю цітокіны LPS, тым самым мадулюючы прыроджаны імунны адказ60,61.Гэта мембранны бялок з дзевяццю багатымі лейцынам паўторамі (LRR) і гамалагічным матывам кальмадуліна (CH) у яго эктадамене, за якім ідзе трансмембранны дамен (TMD) 60, 62.Паведамляецца, што дамены CH апасродкуюць бялкова-бялковыя ўзаемадзеянні 60 .Участак каля 300 амінакіслот паміж даменамі LRR і CH адносна даступны, але неўпарадкаваны.Грунтуючыся на функцыі неўпарадкаваных абласцей як медыятараў бялкова-бялковых сетак і везикулярного транспарту 63, мы выявілі, што большасць бялковых узаемадзеянняў адбываецца ў неўпарадкаваных абласцях.Узаемадзеянне з MDN1 былі размеркаваны па ўсёй даўжыні бялку, у тым ліку LRR1, LRR6, CH даменаў і выпадковых абласцей, у той час як H2B галоўным чынам звязаны з CH дамена (мал. 6A, B).Характэрна, што ні адно з узаемадзеянняў не ўключала ВНЧС, што сведчыць пра спецыфіку падыходу CLMS (малюнак 6A, B).
Ён належыць да сямейства бялкоў AAA (АТФазы, звязаныя з рознымі відамі дзейнасці).Гэта той самы N-канцавы дамен AAA, які арганізуецца ў гексамернае кольца і выдаляе фактар ​​зборкі з 60S 64 рыбасомнай субадзінак.Акрамя таго, багаты рэгіён Asp/Glu суправаджаецца даменам MIDAS (сайт, які залежыць ад іёнаў металаў).З-за вялікага памеру MDN1 (прыкладна 5600 амінакіслот) і яго абмежаванай гамолагі з добра вывучанымі вавёркамі мала што вядома пра яго структуру і функцыі ў арганізме чалавека.Мы вызначылі HLA-A, H2B і LRCH4 у якасці партнёраў па звязванні MDN1 і выявілі іх арыентацыю ў выглядзе бялковых комплексаў у PyMol (мал. 6A, B).Гэтыя тры вавёркі ўзаемадзейнічаюць з даменам AAA, дынеінападобным лінкерным даменам і, магчыма, з даменам MIDAS MDN1.У папярэднім дакладзе афінная ачыстка бялкоў прынады ідэнтыфікавала MDN1 як бялок, звязаны з гістонам H2B67.Акрамя таго, нядаўняе даследаванне таксама паведаміла пра ўзаемадзеянне паміж MDN і HLA-B у клетках HCT116 з выкарыстаннем афінна-ачышчанай мас-спектраметрыі, што пацвярджае нашы высновы68.Ідэнтыфікацыя гэтага комплексу ва ўзорах, апрацаваных IFNα, паказвае на ролю MDN1 у сігналізацыі інтэрферону.
Паколькі гены HLA вельмі паліморфныя, мы вынялі секвеніруючыя чытанні, якія адлюстроўваюць HLA-A, -B і -C з дадзеных секвенирования РНК клетак Flo-1 (дадзеныя не паказаны).Пептыдныя паслядоўнасці, якія адпавядаюць паказанням паслядоўнасці, выявілі значныя адрозненні паміж HLA-A, -B і -C у рэгіёнах, дзе звязаныя пептыды знаходзяцца ў HLA-A (малюнак S3).Акрамя таго, мы не назіралі міжбялковыя сшыўкі малекул HLA-B/C з вавёркамі H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Гэта сведчыць аб тым, што бялковае ўзаемадзеянне паміж HLA-A, MDN1, LRCH1 і HMGA1 з'яўляецца спецыфічным для HLA-A.Акрамя таго, пратэёмны аналіз несшытых узораў (табліца S4) паказаў, што HLA-A мае больш высокі ахоп паслядоўнасці ў параўнанні з HLA-B або HLA-C.Пептыды, ідэнтыфікаваныя для HLA-A, былі высокай інтэнсіўнасці як у апрацаваных IFNα, так і ў неапрацаваных узорах.
Каб гарантаваць, што выяўленыя тут узаемадзеянні не адбываюцца з-за неспецыфічнага перакрыжаванага зшывання двух бялкоў у непасрэднай прасторавай блізкасці, мы дадаткова пацвердзілі два новыя фактары ўзаемадзеяння HLA-A, правёўшы аналіз сумеснай імунапрэцыпітацыі.Узаемадзеянне HLA-A з эндагеннымі MDN1 і H2B было выяўлена як у апрацаваных IFNα, так і ў неапрацаваных клетках Flo-1 (малюнак 7, малюнак S4).Мы пацвердзілі, што HLA-A быў захоплены H2B у иммунопреципитатах і што гэтая сувязь была звязана з лячэннем IFNα, паколькі HLA-A адсутнічаў ва ўзорах иммунопреципитатов з неапрацаваных клетак (малюнак 7A).Аднак нашы дадзеныя паказваюць, што IFNα па-рознаму рэгулюе звязванне HLA-A з H2B і MDN1.IFNα індукуе сувязь паміж H2B і HLA-A, але зніжае яе сувязь з MDN1.Мы выявілі, што MDN1 быў звязаны з HLA-A ў кантрольнай групе, і даданне IFNα памяншала гэта ўзаемадзеянне незалежна ад індукцыі MDN1 IFNα (малюнак 7B,C).Акрамя таго, иммунопреципитация HLA-A захапіла H2B ў клетках A549 (мал. S4), мяркуючы, што гэта ўзаемадзеянне не залежыць ад тыпу клеткі.У сукупнасці гэтыя вынікі пацвярджаюць апасродкаванае інтэрферонам узаемадзеянне HLA-A з H2B і MDN1.
HLA-A сумесна ачышчае H2B і MDN1.Рэпрэзентатыўныя эндагенныя імунаблоты H2B (A) і MDN1 (B) былі імунапрэцыпітаваныя з клетак Flo-1, апрацаваных IFNα, і даследаваны на ўказаныя антыцелы.IgG мышы і труса выкарыстоўвалі ў якасці адмоўнага кантролю.(C) Адносныя колькасці (уваход) розных антыгенаў намаляваны иммуноблотами, даследаванымі супраць паказаных антыцелаў, β-актын выкарыстоўваўся ў якасці кантролю нагрузкі.
Мы выкарысталі мадэляванне малекулярнай дынамікі ў якасці альтэрнатыўнага падыходу, каб зразумець канфармацыйную дынаміку бялкоў, якія ўваходзяць у гэты комплекс (малюнак 8).Першапачатковы бялок-бялковы док-экран з выкарыстаннем MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Манрэаль, Квебек, Канада) пакет прапанаваў магчымыя канфармацыі, якія адрозніваюцца паміж гэтымі вавёркамі (мал. 8A).
Конформационная дынаміка магчымых сетак паміж комплексамі H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A і H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Левая панэль - гэта 2D-карта (створаная ў праграмным забеспячэнні SIM-XL) унутрымалекулярных (чырвоны) і міжмалекулярных (сіні) перакрыжаваных сувязей (межавая адзнака перакрыжаваных сувязяў усталявана на 3,5).Акрамя таго, ідэнтыфікаваныя астаткі сшывання пазначаны на структурах бялкоў H2B, HLA-A і HMGA1.Звязаныя канфармацыі гэтых бялкоў былі вынятыя з дапамогай док-канаве, рэалізаванага ў пакеце MOE.На левай ніжняй панэлі паказаны розныя магчымыя канфармацыі комплексаў H2B-HLA-A і HMGA1-HLA-A з розным сродством да звязвання бялок-бялок (GBVI/WSA dG; ккал/моль).(B) Стандартнае адхіленне (RMSD) атамных пазіцый (за выключэннем атамаў вадароду) для кожнай структуры бялку.(C) Міжмалекулярныя бялок-бялковыя ўзаемадзеяння вадароднай сувязі з розных змадэляваных комплексаў з улікам канкрэтных узаемадзеянняў працягласцю ≥ 10 нс.Адлегласць адсечкі донар-акцэптар h-сувязі была ўстаноўлена на 3,5 Å, а вугал адсячэння донар-H-акцэптар быў усталяваны на ≥ 160°–180°.(D) Пазначаныя рэшткі, якія ўтвараюць бялкова-бялковыя ўзаемадзеянні HLA-A з адпаведнымі партнёрамі, якія ахопліваюць ≥ 20 нс, вынятыя з фіктыўных комплексаў HLA-A-H2B і HLA-A-HMGA1.Бялковыя структуры ўяўляюць сабой сярэднюю структуру 100 нс MDS.(E) Узаемадзеянне паміж комплексамі HLA-A-H2B і HLA-A-HMGA1 у параўнанні з узаемадзеяннямі, якія адсочваюцца з дапамогай мадэлявання H2B-HLA на працягу 100 нс на аснове сайта ўзаемадзеяння K або S паміж двума пептыдамі.Парогавае значэнне для ацэнкі крыжаваных сувязяў было ўстаноўлена роўным 3,0, і былі ўлічаны канкрэтныя ўзаемадзеяння ад MDS з працягласцю ≥ 10 нс.Структуры бялкоў візуалізавалі з дапамогай пакетаў BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., Сан-Дыега, Каліфорнія, ЗША) і Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Манрэаль, Квебек, Канада).
Стабільнасць малекул HLA-A з цягам часу (стандартнае адхіленне; RMSD або стандартнае адхіленне; RMSF) паказала, што прысутнасць бялкоў H2B або HMGA1 у комплексах стабілізавала HLA-A (малюнак 8B, малюнак S5).Бялок HMGA1 цесна звязваецца з сайтам B2M HLA-A, выклікаючы стабільнасць амінакіслот HLA-A ў комплексе HLA-A-HMGA1 або H2B-HLA-A-HMGA1 (малюнак 8B, малюнак S5).H2B і HMGA1 паказалі лепшае звязванне з HLA-A ў комплексе H2B-HLA-A-HMGA1 у параўнанні са звязваннем HLA-A толькі з H2B або HMGA1 (малюнак 8C, D; табліца S5).Рэшткі, якія ўдзельнічаюць у вадародных сувязях (мадэляванае MD высокае запаўненне ≥ 10 нс), супадаюць з месцамі ўзаемадзеяння CLMS (рэшткі K або S) у комплексе, што сведчыць аб тым, што ўзаемадзеянні, ідэнтыфікаваныя CLMS, вельмі надзейныя.Надзейнасць (мал. 8E).Пры мадэляванні CLMS і MD было выяўлена, што рэшткі HLA-A паміж прыкладна 190-210 і прыкладна 200-220 амінакіслотамі звязваюць H2B і HMGA1 адпаведна (мал. 8E).
Бялок-бялковыя ўзаемадзеяння ўтвараюць дынамічныя структурныя сеткі, якія апасродкуюць ўнутрыклеткавую сувязь у адказ на пэўныя стымулы.Паколькі многія метады пратэёмікі выяўляюць змены ў агульным раўнамерным стане бялку, дынаміка ўзаемадзеяння бялок-бялок патрабуе дадатковых інструментаў для ўлоўлівання інтэрфейсаў звязвання, і CLMS з'яўляецца адным з такіх інструментаў.Сігнальная сістэма інтэрферону - гэта сетка цітокінаў, якая дазваляе клеткам рэагаваць на шэраг патагенных і ўнутраных паталагічных сігналаў навакольнага асяроддзя, кульмінацыяй якіх з'яўляецца індукцыя падмностваў інтэрферон-індукаваных бялкоў.Экстракцыя трыптычных пептыдаў з несшитых і папярочна-сшытых клетак дазваляе падлічваць пептыды, узбагачаць шлях і размеркаваць пептыды па даўжыні з пэўнай інтэнсіўнасцю LFQ.Кананічныя вавёркі, індукаваныя інтэрферонам, былі ідэнтыфікаваныя як станоўчы ўнутраны кантроль, у той час як назіраліся новыя міжмалекулярныя і ўнутрымалекулярныя сшытыя адукты кананічных бялкоў, індукаваных інтэрферонам, такіх як MX1, UP18, OAS3 і STAT1.Былі даследаваны розныя структурныя асаблівасці і ўзаемадзеянне ў функцыянальных абласцях.
Нашы вынікі падкрэсліваюць, што HLA-A злучаецца з H2B залежна ад IFNα.Наша праца ўяўляе сабой цікавы шлях для далейшага вывучэння сумеснай лакалізацыі гэтых двух комплексаў.Было б таксама цікава пашырыць падыход CLMS да панэлі клеткавых ліній, каб вызначыць незалежныя ад тыпу клетак інтэрферон-апасродкаваныя ўзаемадзеяння бялку.Нарэшце, мы выкарыстоўвалі мадэляванне МД у якасці альтэрнатыўнага падыходу для разумення канфармацыйнай дынамікі бялкоў, якія ўдзельнічаюць у комплексе H2BFS-HLA-A-HMGA1, які адсочвае ўнутрымалекулярныя і міжмалекулярныя перакрыжаваныя перашкоды.Высновы з дадзеных CLMS паказваюць на магчымасць розных канфармацый бялкоў H2BFS, HLA-A і HMGA1.Магчымыя розныя канфармацыі паміж гэтымі докінг-бялковымі комплексамі выявілі некалькі ўзаемадзеянняў, падобных да тых, якія назіраліся ў наборы дадзеных CLMS.Адной з галоўных пераваг нашага метаду з'яўляецца тое, што ён дазваляе лёгка ідэнтыфікаваць ўзаемадзейнічаючыя вельмі паліморфныя гены, такія як HLA, таму будзе цікава вывучыць узаемадзеянне бялкоў, характэрных для гаплатыпу HLA, якія інакш цяжка вывучыць.У сукупнасці нашы дадзеныя дэманструюць, што CLMS можна выкарыстоўваць для пашырэння нашага разумення сігнальных сетак, выкліканых інтэрферонам, і стварыць аснову для вывучэння больш складаных міжклеткавых сістэм у мікраасяроддзі пухліны.
Клеткі Flo-1 былі атрыманы з ATCC і захоўваліся ў DMEM (Gibco) з дадаткам 1% пеніцыліну/стрэптаміцыну (Invitrogen), 10% фетальной бычынай сыроваткі (Gibco) і захоўваліся пры 37°C і 5% CO2.Інкубацыйны.
Клеткі Flo-1 культывавалі ў 6-лункавых пласцінах і на наступны дзень клеткі апрацоўвалі 10 нг/мл IFNα14 на працягу 24 гадзін да прыблізна 80% канфлюэнтнасці.Клеткі прамывалі тры разы PBS і лигировали са свежапрыгатаваным DSS (Thermo Fisher Scientific) (раствораным у ДМСО) у PBS на працягу 5 хвілін пры 37°C да канчатковай канцэнтрацыі 0,5 ммоль.Рэакцыя сшывання DSS была заменена на PBS, а рэшткавы DSS быў патушаны даданнем 20 мМ трис (рн 8,0) у PBS на працягу 15 хвілін пры 37 ° C.Клеткі збіралі шляхам выскрабання і збіралі ў прабіркі з нізкім узроўнем звязвання (кісларод).
Асадак клетак лізіравалі 300 мкл буфера для лізісу мачавіны (8 М мачавіны, 0,1 М Трыс, рн 8,5) на працягу 30 хвілін пры пакаёвай тэмпературы з перыядычным устрэсваннем.Усе этапы цэнтрыфугавання праводзілі пры 14000 хg пры 8°C.Цэнтрыфугуйце лізат на працягу 10 хвілін і перанясіце супернатант у новую прабірку.Астатнія празрыстыя часціцы растваралі ў 150 мкл другога буфера для лізісу (2 М мачавіна, 2% (вага/аб'ём) SDS (дадэцылсульфат натрыю)) на працягу 30 хвілін або больш да атрымання аднастайнага воднага раствора.Лізат цэнтрыфугавалі на працягу 20 хвілін і супернатант змешвалі з лізатам, атрыманым на папярэднім этапе.Канцэнтрацыі бялку ацэньвалі з дапамогай аналізу Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы для працэдур мікрапланшэтаў.Узоры хутка замарожвалі ў вадкім азоце і захоўвалі пры -80°C.
Прыблізна 100 мкг растваральнага пашытага бялку апрацоўвалі з дапамогай мадыфікаванага пратаколу падрыхтоўкі ўзораў фільтрацыі (FASP), як апісана Wisniewski et al.69 Карацей кажучы, бялок сшываюць з 200 мкл мочавіннага буфера (8 М мачавіны ў 0,1 М Трыс, pH 8,5), змешваюць і размяжоўваюць напалову.Усе этапы цэнтрыфугавання праводзілі пры 14000 хg пры 25°C.Першую палову пашытага бялковага лізата пераносілі ў цэнтрабежны фільтр Microcon 10 кДа, абсталяваны мембранай Ultracel-10 (Merck), з наступным цэнтрыфугаваннем на фільтры на працягу 25 хвілін.Затым дадайце ў фільтр другую палову бялку і паўтарыце тыя ж дзеянні.Аднаўленне бялку праводзілі шляхам дадання 100 мкл 17 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфингидрахларыд (TCEP) у мачавінным буферы.Аднаўленне змешвалі на термомиксере пры 600 абаротах у хвіліну на працягу 30 хвілін пры 37°C.Акрамя таго, калонку центрифугировали і адноўлены сшыты бялок алкилировали з выкарыстаннем 100 мкл 50 мМ ёдацетаміду ў мачавінным буферы.Рэакцыю алкілавання праводзяць пры пакаёвай тэмпературы на працягу 20 хвілін у цемры.Павярніце калонку, прамыйце сценкі калонкі 3 разы 100 мкл карбаміднага буфера, а затым адцэнтрыфугуйце.Гэтую ж аперацыю праводзілі 3 разы з выкарыстаннем 100 мкл 100 мМ бікарбанату амонія.Перад трипсинизацией заменіце прабірку для збору на новую.Дадайце буфер для стрававання, які змяшчае 50 мМ бікарбанату амонія і 1 мкл трыпсінаў, разведзеных у буферы для трыпсінаў (Promega).Стаўленне трыпсінаў да бялку падтрымлівалі на ўзроўні каля 1:33, і рэакцыі стрававання інкубавалі на працягу ночы пры 37°C у вільготнай камеры.Пашыты пептыда элюіравалі з фільтра цэнтрыфугаваннем на працягу 25 хвілін.Аднаўленне пептыдаў было палепшана шляхам дадання 50 мкл 0,5 М NaCl да фільтра з наступным цэнтрыфугаваннем на працягу 25 хвілін.
Калонкі C18 Micro Spin (Гарвардскі апарат) выкарыстоўваліся для абяссольвання пашытых трыптычных пептыдаў у адпаведнасці з пратаколам, апісаным Bouchal et al.70 з невялікімі мадыфікацыямі.Коратка, спінавыя калоны C18 актывавалі трыма прамываннямі 0,1% мурашынай кіслаты (FA) у ацэтанітрыле (AcN) (Merck) і двума прамываннямі 0,1% FA.Калонку гидратировали 0,1% FA на працягу 15 хвілін.Загрузіце ўзоры ў спінінг-калонкі і прамыйце 3 разы 0,1% FA.Абяссоленыя пептыды паслядоўна элюіравалі паэтапным градыентам з выкарыстаннем 50%, 80% і 100% AcN у 0,1% FA.Узоры сушылі ў канцэнтратары SpeedVac Plus (Eppendorf) да поўнага знікнення рэшткаў вадкасці.Элюированные пептыды растваралі ў 100 мкл 0,08% трифторуксусной кіслаты ў 2,5% AcN і канцэнтрацыі вымяралі на NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Прыкладна 1 мкг пашытага пептыда на ўзор быў уведзены ў сістэму ВХ-МС/МС.
Сшытыя пептыды падзялялі на сістэме UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific), падлучанай да мас-спектрометра Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Сшытыя пептыды былі сабраны на 300 мкм ID, 5 мм даўжынёй мк-папярэдняй калонкі C18 калонцы захопу, напоўненай C18 PepMap100 сарбентам і 5 мкм PepMap сарбентам (Thermo Scientific).Загрузіце паток помпы з хуткасцю 5 мкл/мін 0,08% трыфторуксуснай кіслаты, растворанай у 2,5% AcN.Пашытыя пептыды падзялялі на аналітычнай калонцы з плаўленага дыяксіду крэмнія з унутраным дыяметрам 75 мкм і даўжынёй 150 мм, запоўненай 2 мкм сарбентам PepMap (Thermo Scientific).Мабільныя фазы A і B складаліся з 0,1% FA ў вадзе і 0,1% FA ў ацэтанітрыле адпаведна.Градыент пачынаецца з 2,5% B і лінейна павялічваецца да 40% B на працягу 90 хвілін, затым да 90% B на працягу наступных 2 хвілін.Склад рухомай фазы падтрымліваўся на ўзроўні 90% B на працягу 10 хвілін, а затым лінейна зніжаўся да 2,5% B на працягу 2 хвілін.Сшытыя пептыды, вымытыя з аналітычнай калонкі, былі іянізаваны ў крыніцы іянізацыі з нанаэлектрараспыленнем (NSI) і ўведзены ў мас-спектрометр Exploris 480 (Thermo Scientific).
Мас-спектрометр Orbitrap Exploris 480 працаваў у рэжыме станоўчай карэляцыі дадзеных.Нармалізаваная мэта AGC была ўстаноўлена на 300% з максімальным часам уводу 50 мс.Выяўленне монаізатопнага піку было ўстаноўлена для пептыдаў.Мінімальная іённая сіла папярэдніка была ўстаноўлена роўнай 5,0e3, і ў эксперыменты былі ўключаны стану зарада папярэдніка да +8.
Час цыклу паміж асноўнымі сканаваннямі ў рэжыме карэляцыі даных быў усталяваны на 2,5 секунды.Дынамічнае выключэнне масы было ўстаноўлена на 20 с пасля першай фрагментацыі іёна-папярэдніка.Тып нармалізаванай энергіі сутыкнення з фіксаваным рэжымам энергіі сутыкнення быў абраны ў сканаванні MS/MS, якое залежыць ад даных.Раздзяленне Orbitrap было ўстаноўлена на 15 000, а мэта AGC на 100%.Карыстальніцкі максімальны час увядзення складае 60 мілісекунд.
Перш чым адсочваць бялкова-бялковую сетку ў сшытых узорах, мы апрацавалі неапрацаваныя файлы з дапамогай пакета MaxQuant (версія 1.6.12.0)26,27 для ідэнтыфікацыі прасочваемых пептыдаў/вавёркаў ва ўзорах.Акрамя таго, падобныя пратэёмныя аналізы праводзіліся на несшытых узорах Flo-1, апрацаваных і неапрацаваных IFNα.Даныя MS/MS шукаліся ў базе дадзеных чалавека UniProt (www.uniprot.org) (загружана 12 жніўня 2020 г., змяшчае 75 093 запісы) з дапамогай убудаванай пошукавай сістэмы Andromeda27.Пошук праводзіўся без указання спецыфікі фермента і розных мадыфікацый дэзамідавання (N, Q) і акіслення (М).Дапушчальныя адхіленні масы папярэдніка былі ўстаноўлены на 20 частак на мільён, а іёны прадукту - на 0,02 Да.Пачатковае і максімальнае адхіленне масы было ўстаноўлена на 10 праміле.Максімальная маса пептыда была ўстаноўлена ў 4600 Да, а падабенства паслядоўнасці было ўстаноўлена паміж 7 і 25 амінакіслотамі (аа).Далейшы статыстычны аналіз праводзіўся з дапамогай праграмы Perseus (версія 1.6.10.45).Змест бялку разлічвалі шляхам нармалізацыі спектральнай інтэнсіўнасці бялку (інтэнсіўнасць LFQ; немаркіраваная колькасная ацэнка)27, а значэнні інтэнсіўнасці пераўтваралі ў Log2.Іерархічная кластэрызацыя бялкоў, ідэнтыфікаваных па іх інтэнсіўнасці пептыдаў, была пабудавана з выкарыстаннем пакета pheatmap (v1.0.12) у R (v 4.1.2).Аналіз узбагачэння шляху праводзіўся з выкарыстаннем базы дадзеных шляхоў Reactome для бялкоў, апрацаваных IFNα, якія былі актываваныя больш чым у чатыры разы ў параўнанні з неапрацаванымі ўзорамі.
Ідэнтыфікацыя лізіну (K) або серыну (S) спецыфічных хімічных сшыванняў бялковых комплексаў, кантраляваных ВХ-МС/МС, была праведзена з дапамогай машыны спектраскапічнай ідэнтыфікацыі (SIM-XL) для пашытых пептыдаў (SIM-XL)29.Па-першае, магчымае ўзаемадзеянне паміж асацыяванымі з інтэрферонам (IFN) генамі сігнатуры ўстойлівасці да пашкоджання ДНК (IRDS) было даследавана з выкарыстаннем набору дадзеных бялку IRDS, апісанага ў Padariya et al.28.Скрынінг усіх умоў і паўтораў усяго UniProt чалавека патрабуе вылічэнняў, таму ўся база дадзеных UniProt чалавека (www.uniprot.org) (спампавана 12 жніўня 2020 г., змяшчае 75 093 запісы) супраць паўтораў, апрацаваных IFNα.Адзін з фільтраў для ўзаемадзеяння з высокім даверам.
У SIM-XL для сшывальніка (XL) выкарыстоўваўся DSS, а зрух вагі XL і зрух вагі мадыфікацыі былі ўстаноўлены на 138,06 і ​​156,07 адпаведна.Разглядаюцца наступныя сайты рэакцыі сшывання: KK, KS і KN-TERM, без рэпарцёрных іёнаў.Для папярэдніка і фрагмента праміле было ўстаноўлена 20, а парог Xrea - 0,15.Трыпсін лічыўся цалкам спецыфічным, і быў рэалізаваны метад фрагментацыі высокаэнергетычнай C-пасткі (HCD).Парог дынамічнага зніжэння DB XCorr і мінімальная колькасць пептыдаў для дынамічнага зніжэння DB былі ўсталяваныя на 2,5 і 2 адпаведна.Іншыя параметры: монаізатопная верагоднасць і пік супадзенняў, мінімум 4 астаткі АА на ланцуг і максімальны зарад ланцуга, а таксама 3 максімумы прапушчаных расшчапленняў.
Мадэльныя структуры бялку былі створаны з дапамогай сервера Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 з выкарыстаннем прынцыпаў мадэлявання гамалогіі і рэалізацыі «Схаванага метаду Маркава».Phyre2 стварае мадэльныя структуры на аснове выраўноўвання паслядоўнасці з вядомымі бялковымі структурамі.Для бялкоў H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 і MDN1 выкарыстоўваліся шаблонныя структуры 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 і 6i2665.Акрамя таго, таксама была разгледжана структура AlphaFold71 MX1, UBP18 і ROBO1.Структура бялку была візуалізавана з дапамогай пакета BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, Сан-Дыега, Каліфорнія, ЗША) і пакета Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Манрэаль, Квебек, Канада).