ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Дуплексная зварная труба для хімічнай прамысловасці хімічнага кампанента. Дэфіцыт SPECC1L прыводзіць да павышэння стабільнасці зрошчаных злучэнняў і памяншэння выпадзення клетак чэрапна-нервовага грэбня.

Дзякуй за наведванне Nature.com.Вы выкарыстоўваеце версію браўзера з абмежаванай падтрымкай CSS.Для найлепшага вопыту мы рэкамендуем вам выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer).Акрамя таго, каб забяспечыць пастаянную падтрымку, мы паказваем сайт без стыляў і JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Дуплексная зварная труба для хімічнай прамысловасці

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.з'яўляецца вядучым вытворцам, які спецыялізуецца на бясшвовых трубах з нержавеючай сталі, ярка отожженных трубах, бясшвовых спіральных трубах і г.д.Для таго, каб палегчыць кліентам, мы зварныя трубы і трубкі таксама.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.мае самае сучаснае вытворчае і выпрабавальнае абсталяванне.Мы можам цалкам задаволіць вашыя патрабаванні.У адпаведнасці са стандартам вельмі строга, трубы, якія вырабляюцца намі заўсёды маюць правільны OD і WT талерантнасці.Кантроль допуску строга адпавядае стандартам вытворчасці.Нашай прадукцыяй кліенты заўсёды задаволеныя.Кліенты, якія купляюць нашу прадукцыю, ствараюць большы прыбытак.
a) OD (Вонкавы дыяметр): ад 3,18 мм да 101,6 мм
b) WT (таўшчыня сценкі): ад 0,5 мм да 20 мм
в) Даўжыня: у адпаведнасці з патрабаваннем кліента
d) Стандарты: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 і г.д
e) Метад працэсу: ERW, EFW і г.д

Паўзункі, якія паказваюць тры артыкулы на слайдзе.Для перамяшчэння па слайдах выкарыстоўвайце кнопкі "Назад" і "Далей" або кнопкі кантролера слайдаў у канцы для перамяшчэння па кожным слайдзе.
Клеткі чэрапнага нервовага грэбня (CNCC) адслойваюцца ад эмбрыянальных нервовых зморшчын і мігруюць у глоточные дугі, якія ўтвараюць большасць структур сярэдняй часткі твару.Дысфункцыя CNCC гуляе важную ролю ў этыялогіі аральна-асабовай расколіны, распаўсюджанага прыроджанага пароку развіцця.Гетерозиготные мутацыі SPECC1L выяўленыя ў пацыентаў з атыповымі і синдромными расколінамі.Тут мы паведамляем пра ўзмоцненае афарбоўванне кампанентаў кананічнага адгезійнага злучэння (AJ), β-катэніна і E-кадгерыну ў культывуемых накдаўн-клетках SPECC1L, а электронныя мікрафатаграфіі паказваюць апікальна-базальную дыфузію AJ.Каб зразумець ролю SPECC1L у чэрапна-тварным марфагенезе, мы стварылі мадэль мышы з дэфіцытам Specc1l.Гомозиготные мутанты смяротныя для эмбрыёна і дэманструюць парушэнне закрыцця нервовай трубкі і ламініраванне CNCC.Афарбоўка бялку AJ павялічваецца ў мутантных нервовых зморшчынах.Гэты дэфект AJ супадае з дэфектам расслаення CNCC, які патрабуе растварэння AJ.Акрамя таго, у мутантаў Specc11 зніжана перадача сігналаў PI3K-AKT і павышаны апоптоз.In vitro лёгкага інгібіравання сігналізацыі PI3K-AKT у клетках дзікага тыпу было дастаткова, каб выклікаць змены AJ.Важна адзначыць, што змены AJ, выкліканыя накдаўнам SPECC1L, могуць быць адменены шляхам актывацыі шляху PI3K-AKT.У сукупнасці гэтыя дадзеныя сведчаць аб тым, што SPECC1L, як новы рэгулятар сігналізацыі PI3K-AKT і біялогіі AJ, неабходны для закрыцця нервовай трубкі і стратыфікацыі CNCC.
Клеткі краніяльнага нервовага грэбня (CNCC) лакалізуюцца ў дорсальной нейроэктодерме і адлучаюцца ад нейроэпителия развіваюцца нервовых зморшчын праз працэс, які ўключае эпітэліяльна-мезенхімальны пераход (EMT)1,2,3.Папярэдне мігруючыя эпітэліяльныя CNCC парушаюць міжклеткавыя злучэнні і ператвараюцца ў мігруючыя мезенхімальныя CNCC, якія запаўняюць першую і другую дугі глоткі і ўтвараюць большую частку чэрапна-асабовага храстка.Такім чынам, гены, якія рэгулююць функцыю CNCC, часта парушаюцца ў этыялогіі чэрапна-тварных прыроджаных анамалій, такіх як рота-асабовыя расколіны, якія часцей за ўсё дзівяць 1/800 нованароджаных толькі ў ЗША.Адно з прыроджаных уродств8.
Адслаенне CNCC супадае з закрыццём пярэдняй нервовай трубкі паміж 8,5 і 9,5 днямі эмбрыянальнага развіцця ў мышэй.Мутанты шэрагу генаў, звязаных з ротава-асабовай расколінай мышы, таксама выяўляюць некаторыя формы дэфекту нервовай трубкі, у тым ліку Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 і Pdgfrα12.Аднак працэсы закрыцця нервовай трубкі і стратыфікацыі CNCC можна лічыць незалежнымі, паколькі мыш-мутант Splotch (Pax3) дэманструе дэфекты закрыцця нервовай трубкі без усялякага ўплыву на стратыфікацыю або міграцыю CNCC 13,14.Дадатковыя мадэлі мышэй з дэфектамі ў рассякання CNCC і закрыцця нервовай трубкі дапамогуць акрэсліць агульную малекулярную аснову гэтых двух працэсаў.
Ізаляцыя CNCC з нейраэпіцеліяльных клетак патрабуе растварэння адгезійных злучэнняў (AJ), якія складаюцца з бялковых комплексаў, якія змяшчаюць, сярод іншага, E-кадгерын, β-катэнін, α-E-катэнін і α-актынін, звязаныя з ніткамі актыну 2 Даследаванні празмернай экспрэсіі E-кадгерыну ў нервовых зморшчынах паказалі памяншэнне або затрымку расслаення CNCC.І наадварот, падаўленне Е-кадгерыну прыводзіць да ранняй стратыфікацыі15,16.Многія з фактараў, якія апасродкуюць EMT падчас стратыфікацыі CNCC, - гэта фактары транскрыпцыі (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) і вавёркі рэмадэлявання пазаклеткавага матрікса (ECM), такія як матрыксныя металапратэіназы (MMP), аднак CNCC з'яўляюцца прамымі рэгулятарамі цыташкілета AJ яшчэ не вядома.Вядома, што шлях PI3K-AKT супрацьстаіць узроўням Е-кадгерыну, галоўным чынам з даследаванняў рака17.Нядаўнія даследаванні паказалі, што страта перадачы сігналу PI3K-AKT на аснове PDGFα ў мышэй прыводзіць да чэрапна-тварных анамалій, уключаючы расколіну неба і дэфекты нервовай трубкі12.Аднак сувязь паміж шляхам PI3K-AKT і стабільнасцю AJ пры стратыфікацыі CNCC незразумелая.
Раней мы ідэнтыфікавалі SPECC1L як першы мутантны ген у двух людзей з сур'ёзнай расколінай, якая распасціраецца ад рота да вока, вядомай як касая расколіна (ObFC) або расколіна Тэсье IV18.Мутацыі SPECC1L былі ідэнтыфікаваныя ў дзвюх сем'ях з некалькімі пакаленнямі з аўтасомна-дамінантным сіндромам Opitz G/BBB (OMIM #145410), у якіх пацярпелыя людзі дэманстравалі гіпердыстанцыю і заячую губу/неба19, і ў адной сям'і з сіндромам празмернай дыстанцыі Tibi (OMIM #145420)20 .больш за палову выпадкаў сіндрому Opitz G/BBB з'яўляюцца Х-счэпленымі (OMIM #300000) і выкліканыя мутацыямі ў гене MID1, які кадуе бялок 22 клеткавага шкілета, звязанага з мікратрубачкамі.Мы мяркуем, што SPECC1L, таксама бялок, звязаны з мікратрубачкамі і актынавым цыташкілетам, можа апасродкаваць сігналізацыю, неабходную для рэканструкцыі актынавага цыташкілета падчас клеткавай адгезіі і міграцыі 18 .Дзякуючы даследаванням in vitro і in vivo, мы зараз апісваем SPECC1L як новы рэгулятар стабільнасці AJ праз сігналізацыю PI3K-AKT.На клеткавым узроўні дэфіцыт SPECC1L прыводзіў да зніжэння ўзроўню бялку pan-AKT і павелічэння апікальна-базальнай дысперсіі AJ, што было ліквідавана хімічнай актывацыяй шляху AKT.In vivo эмбрыёны з дэфіцытам Specc11 дэманструюць парушэнне закрыцця нервовай трубкі і паменшанае рассяканне CNCC.Такім чынам, SPECC1L функцыянуе ў высокарэгуляванай сігналізацыі на аснове клеткавай адгезіі, неабходнай для нармальнай функцыі CNCC падчас марфагенезу асобы.
Каб ахарактарызаваць ролю SPECC1L на клеткавым узроўні, мы выкарысталі раней апісаную лінію стабільных клетак остеосаркомы U2OS з дэфіцытам SPECC1L18.Гэтыя стабільныя клеткі U2OS з накдаўнам SPECC1L (kd) мелі ўмеранае (на 60–70%) зніжэнне ўзроўню транскрыптаў і бялкоў SPECC1L разам з дэфектамі міграцыі і рэарганізацыі цыташкілета актыну 18. Наадварот, сур'ёзнае часовае зніжэнне ў Было паказана, што SPECC1L прыводзіць да мітатычных дэфектаў 23.Пасля далейшай характарыстыкі мы выявілі, што нашы стабільныя клеткі SPECC1L-kd змянілі марфалогію пры вельмі высокай ступені зліцця (малюнак 1).Асобныя кантрольныя клеткі і клеткі kd пры нізкім зліцці выглядалі падобна (малюнак 1A, D).Праз 24 гадзіны пасля зліцця кантрольныя клеткі захавалі кубападобную форму (мал. 1B, E), а клеткі SPECC1L-kd падоўжыліся (мал. 1C, F).Ступень гэтай змены формы клеткі была зафіксавана з дапамогай жывой візуалізацыі кантрольных клетак і клетак kd (фільм 1) in vivo.Каб вызначыць ролю SPECC1L у злітных клетках, мы спачатку вывучылі яго экспрэсію.Мы выявілі, што ўзровень бялку SPECC1L павялічваецца пры зліцці (малюнак 1G), у той час як узровень транскрыптаў SPECC1L не павышаецца (малюнак 1H).Акрамя таго, па меры павелічэння шчыльнасці клетак бялок SPECC1L назапашваўся на міжклеткавых межах (мал. 2A-E), прычым карціна перакрывалася з мембранна-асацыяваным β-катенінам (мал. 2A'-E').Улічваючы сувязь SPECC1L з актынавым цыташкілетам 18,23, мы выказалі здагадку, што SPECC1L узаемадзейнічае з актын-адгезійнымі злучэннямі (AJ).
(AF) SPECC1L накдаўн (DF) клеткі падаўжаюцца пры высокай зліцці (F) у параўнанні з кантрольнымі клеткамі U2OS (AC).Тут паказаны тры з шасці момантаў часу (T1, T3, T6), якія мы абралі для рознай шчыльнасці клетак.(G) Вестэрн-блот аналіз, які паказвае, што бялок SPECC1L стабілізаваны пры высокай ступені зліцця ў параўнанні з нізкай ступенню зліцця ў кантрольных клетках.Вестэрн-блот SPECC1L паказвае чаканую паласу 120 кДа і больш высокую малекулярную паласу, магчыма, мадыфікаваную пасля трансляцыі (*).Вестэрн-блот аналіз праводзіўся ў аднолькавых умовах для нізкага і высокага зліцця.Выявы, якія паказваюць SPECC1L пры нізкім і высокім зліцці, былі ўзяты з адной і той жа плямы.Тое ж пляма выдалілі і паўторна даследавалі з дапамогай антыцелаў да β-актыну.(H) Колькасны аналіз RT-PCR не паказаў значных змен ва ўзроўні транскрыптаў SPECC1L.Палоскі памылак прадстаўляюць SEM з чатырох незалежных эксперыментаў.
(AE) Мы выбралі шэсць часовых кропак (T1-T6), якія прадстаўляюць дыяпазон шчыльнасцей клетак, каб нармалізаваць аналіз формы клетак і змены AJ у клетках U2OS з накдаўнам SPECC1L (kd).Першыя пяць з гэтых момантаў часу ўключалі асобныя клеткі (T1), 50-70% зліццё дробных клеткавых кластараў (T2), зліццё без змены формы клетак kd (T3), змяненне формы клетак kd (T4) і 24-гадзінныя змены.у задняй форме клетак kd (T5).Бялок SPECC1L быў пераважна рассеяны ў цытаплазме на Т1 (A), але яго назапашванне назіралася на міжклеткавых межах у наступныя моманты часу (B–E, стрэлкі).(FJ) β-катенин паказвае падобнае назапашванне на міжклеткавых межах, звязаных з комплексам AJ.(A'-E') SPECC1L і β-катэнін дэманструюць перакрыцце афарбоўвання на межах клетак пры высокай шчыльнасці клетак (стрэлкі).(F'-J') У клетках SPECC1L-kd афарбоўванне β-катенінам выглядае нармальным пры нізкай шчыльнасці клетак (F'-H'), але пашыраецца па меры змены формы клетак (I', J'; стрэлкі), што сведчыць аб тым, што AJ змяніліся.Пруткі = 10 мкм.
Затым мы паспрабавалі вызначыць уплыў дэфіцыту SPECC1L на AJ.Мы выкарысталі некалькі маркераў, звязаных з AJ, у тым ліку кананічныя кампаненты F-актын, міязін IIb, β-катэнін і E-кадгерын24,25,26,27.Стрэсавыя валакна актыну павялічыліся ў клетках SPECC1L-kd, як апісана раней (мал. 3A, B) 18.Міязін IIb, звязаны з ніткамі актыну, паказаў аналагічнае павелічэнне клетак SPECC1L-kd in vitro (мал. 3C, D).AJ-асацыяваны β-катэнін звязваецца з кадгерынам на клеткавай мембране, дэманструючы нармальную «сотавую» карціну экспрэсіі ў кантрольных кубацытах (мал. 3E, G).Цікава, што на плоскіх малюнках з дапамогай канфакальнай мікраскапіі афарбоўванне β-катэнінам (мал. 3E,F) і E-кадгерынам (мал. 3G,H) на клеткавай мембране канфлюентных SPECC1L-дэфіцытных клетак паказала прыкметныя ўзоры пашыранага афарбоўвання.Гэта пашырэнне AJ-асацыяванага афарбоўвання β-катенина ў клетках kd было найбольш выяўленым пры зліцці, але, здавалася, папярэднічала зменам формы клетак (мал. 2F-J, F'-J').Каб вызначыць фізічную прыроду гэтага пашыранага афарбоўвання AJ, мы даследавалі межы клетак на апікальна-базальнай паверхні клетак SPECC1L-kd U2OS з дапамогай трансмісійнай электроннай мікраскапіі (ПЭМ) (малюнак 3I,J).У адрозненне ад кантрольных клетак (мал. 3I), у якіх былі асобныя электроннашчыльныя вобласці, якія сведчаць аб AJ (стрэлкі), клеткі kd (мал. 3J) паказалі вялікія сумежныя вобласці высокай шчыльнасці электронаў, якія сведчаць аб AJ, уздоўж апікабазальнай плоскасці..Акрамя таго, на папярочных зрэзах мы назіралі шырокія зморшчыны клеткавай мембраны ў клетках kd (мал. S1A, B), што тлумачыць пашыраную карціну палос афарбоўвання β-катеніна і Е-кадгерыну (мал. 3F, H).У падтрымку ролі SPECC1L у AJs, β-катэнін быў сумесна імунапрэцыпітаваны са SPECC1L у лізатах канфлюэнтных клетак U2OS (мал. 3K).Нараўне з пашыраным імунным афарбоўваннем на маркеры AJ аналіз TEM адпавядаў нашай гіпотэзе аб тым, што дэфіцыт SPECC1L павялічвае апікальна-базальную шчыльнасць і дысперсію AJ.
(AH) Павелічэнне афарбоўвання F-актыну ў клетках kd праз 48 гадзін пасля зліцця (T6; A, B).Змененае афарбоўванне міязіну IIb, звязанае з F-акцін (C, D).Плыўная карціна афарбоўвання мембраны β-катэніна і Е-кадгерыну ў кантрольных клетках (E, G) была ўзмоцнена ў клетках SPECC1L-kd (F, H).Пруткі = 10 мкм.(I–J) Электронныя мікрафатаграфіі назірання апікальна-базальнага міжклеткавага злучэння.Кантрольныя клеткі паказваюць выразныя электронна-шчыльныя вобласці, якія паказваюць на ліпкія злучэнні (I, стрэлкі).Наадварот, усё апікальна-базальнае злучэнне ў клетках SPECC1L-kd выглядала электронна-шчыльным (J, стрэлкі), што сведчыць аб падвышанай шчыльнасці і дысперсіі адгезійных злучэнняў.(K) β-катэнін быў сумесна імунапрэцыпітаваны са SPECC1L у канфлюентных лізатах клетак U2OS.Здымак зроблены з адной кропкі і прадстаўляе адзін з чатырох незалежных эксперыментаў.
Каб зразумець ролю SPECC1L у чэрапна-тварным марфагенезе, мы стварылі мышыную мадэль з дэфіцытам Specc1l з выкарыстаннем дзвюх незалежных клеткавых ліній пастак ES, DTM096 і RRH048 (BayGenomics, Каліфорнія), якія прадстаўляюць інтрон 1, а транскрыпты Specc1l былі зафіксаваны пры 15 (мал. 1) .4A, малюнак S2).Геномных месцазнаходжанне вектара-прыманкі было вызначана шляхам секвенирования ўсяго геному і пацверджана ПЦР (мал. S2).Абедзве канструкцыі генных пастак таксама дазвалялі зліццё рэпарцёраў Specc11-lacZ у кадры пасля захопу.Такім чынам, экспрэсія lacZ, вызначаная афарбоўкай X-gal, выкарыстоўвалася ў якасці індыкатара экспрэсіі Specc11.Абодва алелі дэманструюць падобныя мадэлі экспрэсіі lacZ, прычым пастка гена DTM096 у інтроне 1 дэманструе больш моцную экспрэсію, чым RRH048 у інтроне 15 (не паказана).Тым не менш, Specc1l шырока выяўлены, з асабліва моцнай экспрэсіяй у нервовых зморшчынах на E8.5 (малюнак 4B), у нервовай трубцы і асабовых атожылках на E9.5 і E10.5 (малюнак 4C,D), а таксама ў канечнасцях, якія развіваюцца. на E10.5 і вочы (малюнак 4D).Раней мы паведамлялі, што экспрэсія SPECC1L у першай глоточной дузе на E10.5 прысутнічала ў эпітэліі і падлягаючай мезенхіме18, што адпавядае лініі CNCC.Каб праверыць экспрэсію SPECC1L у CNCC, мы правялі нервовыя зморшчыны E8.5 (малюнак 4E-J) і зрэзы чэрапа E9.5 (малюнак 4K-).На E8.5 SPECC1L інтэнсіўна афарбоўвае нервовыя зморшчыны (мал. 4E, H), уключаючы клеткі, афарбаваныя маркерамі NCC (мал. 4G, J).На E9.5 SPECC1L (мал. 4K, N) моцна афарбаваў мігруючыя CNCC, афарбаваныя сумесна з AP2A (мал. 4L, M) або SOX10 (мал. 4O, P).
(A) Схематычнае прадстаўленне гена Specc11 мышы, якое паказвае ўстаўку вектара-прыманкі ў клеткавыя клоны ES DTM096 (інтрон 1) і RRH048 (інтрон 15).(BD) афарбоўванне lacZ гетерозиготных эмбрыёнаў Specc1lDTM096, якое прадстаўляе экспрэсію Specc1l ад E8.5 да E10.5.NE = нейраэктадэрма, NF = нервовая зморшчына, PA1 = першая дужка глоткі.(EP) SPECC1L імуннае афарбоўванне з маркерамі NCC AP2A і SOX10 у E8.5 (NF; EJ) нервовых зморшчынах і E9.5 (KP) зрэзах чэрапа.Афарбоўванне SPECC1L шырока назіралася ў нервовых складках E8.5 (E, H; наканечнікі стрэлак), уключаючы клеткі, пазначаныя AP2A (F, G; наканечнікі стрэлак) і SOX10 (I, J; наканечнікі стрэлак).На E9.5 SPECC1L моцна афарбаваў мігруючыя CNCC (K, N; стрэлкі), пазначаныя AP2A (L, M; стрэлкі) і SOX10 (O, P; стрэлкі).
Скрыжаванне гетерозиготных Specc1lDTM096/+ і Specc1lRRH048/+ мышэй паказвае, што два алелі геннай пасткі не з'яўляюцца камплементарнымі і што складаныя гетэразіготы і эмбрыянальныя гомазіготы для любога алеля геннай пасткі смяротныя для эмбрыёна (табліца S1).Мендэлеўскі каэфіцыент паказвае на зніжэнне ўзроўню выжывальнасці гетэразігот пры нараджэнні (чаканае 1,34 супраць 2,0).Мы адзначылі нізкую перынатальную смяротнасць сярод гетэразігот, у некаторых былі чэрапна-асабовыя анамаліі (мал. S3).Аднак нізкая пенетрантность гэтых перынатальных чэрапна-асабовых фенатыпаў абцяжарвае вывучэнне іх асноўных патофизиологических механізмаў.Такім чынам, мы засяродзіліся на эмбрыянальным летальным фенатыпе гомазіготных мутантаў Specc11.
Большасць складаных гетерозиготных або гомозиготных Specc1lDTM096/RRH048 мутантных эмбрыёнаў не развіваліся пасля E9.5-10.5 (мал. 5A-D), і нервовая трубка не зачынялася спераду (мал. 5B, D), а часам зачынялася ззаду (не паказана) ..Гэты дэфект закрыцця чэрапна-нервовай трубкі быў звязаны з тым, што большасць DLX2, пазначаных CNCC, заставалася ў нервовых зморшчынах на E10.5, што сведчыць аб адсутнасці расслаення (малюнак 5A'-D').Каб вызначыць, ці быў таксама паменшаны агульны памер CNCC, мы пазначылі лініі CNCC з дапамогай GFP у нашых лініях генных пастак з Wnt1-Cre і ROSAmTmG.Мы транслюем адсартаваныя GFP+ NCC і GFP- (RFP+) не-NCC з цэлых эмбрыёнаў.На E9.5 доля адсартаваных па патоку GFP-пазначаных CNCC істотна не змянілася паміж WT і мутантнымі эмбрыёнамі (не паказана), што сведчыць аб нармальнай спецыфікацыі CNCC.Такім чынам, мы выказалі здагадку, што рэшткавае афарбоўванне Wnt1-Cre і DLX2 у адкрытых нервовых зморшчынах (малюнак 5B') было звязана з дэфектным наслаеннем CNCC, магчыма, з-за падвышанай шчыльнасці або дысперсіі клетак AJ, як гэта відаць у клетках SPECC1L-kd.Мы выкарыстоўвалі маркеры NCC SOX10, AP2A і DLX2, каб пацвердзіць наяўнасць CNCC у нервовай зморшчыне (малюнак 5E-R).На E8.5 афарбоўванне нервовай зморшчыны для ўсіх трох маркераў NCC назіралася ў зрэзах WT (мал. 5E, G, I) і мутанта Specc1l (мал. 5F, H, J).На E9.5, калі маркеры NCC афарбоўвалі мігруючыя NCC у зрэзах WT (мал. 5M, O, Q), рэшткавае афарбоўванне NCC назіралася ў адкрытых нервовых зморшчынах эмбрыёнаў Specc1l-мутантаў (мал. 5N, P, R).Паколькі SOX10 і DLX2 адзначаюць мігруючыя CNCC, гэты вынік сведчыць аб тым, што CNCC з дэфіцытам SPECC1L дасягаюць спецыфікацыі пасля міграцыі, але не могуць міграваць з нервовых зморшчын.
Дэфіцыт Specc11 прыводзіць да дэфектнага закрыцця нервовай трубкі, расслаення клетак чэрапна-нервовага грэбня і AJ.
(A, B') E9.5 WT (A) Эмбрыён, які нясе мігруючыя клеткі чэрапна-нервовага грэбня (CNCC), пазначаныя Wnt1-Cre (A').Наадварот, эмбрыёны-мутанты Specc11 паказваюць адкрытыя нервовыя зморшчыны (B), наканечнікі стрэлак) і CNCC, якія не мігравалі (B', наканечнікі стрэлак).(C, D') Выявы ў яркім полі (C, D') і імуннае афарбоўванне (C', D') маркера CNCC DLX2 эмбрыёнаў E10.5 WT (C, C') і Specc1l (D, D').У эмбрыёнаў WT E10.5 DLX2-пазітыўны CNCC каланізуе жаберныя дугі (C', стрэлкі), у той час як у мутантаў прыкметнае афарбоўванне захоўваецца ў адкрытых нервовых зморшчынах (D', стрэлкі) і ў першых глоточных дугах (D', стрэлкі).) з некаторым афарбоўваннем (стрэлкі), якое паказвае на дрэннае расслаенне і міграцыю CNCC.ER) Зрэзы мутантных эмбрыёнаў WT і Specc1l на стадыях E8.5 (E–L) і E9.5 (M–R) былі пазначаны маркерамі NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) і DLX2 (I, J, Q, R).На E8.5 афарбоўванне NCC назіралася ў нервовай зморшчыне дзікага тыпу (NF) і мутантных зрэзах.Сумеснае афарбоўванне SOX10 і β-катеніна ў E8.5 WT (K) і мутанта (L) паказала павышаную афарбоўку β-катэніна на межах клетак у нервовых зморшчынах.На E9.5 назіралася афарбоўванне дзікага тыпу мігруючых CNCC (M, O, Q), у той час як у мутантаў нестратыфікаваныя CNCC афарбоўвалі адкрытыя нервовыя зморшчыны (N, P, R).(S–Z) In vivo аналіз маркіроўкі AJ у каранальных зрэзах эмбрыёнаў WT і Specc11DTM096/RRH048 з мутацыяй E9.5.У правым верхнім куце паказаны прыкладны разрэз.У зрэзах мутантных тканін назіралася падвышаная афарбоўка F-актыній (S, Т) і міязіну IIb (U, V).Падобна вынікам in vitro на мал. 3, у мутантных эмбрыёнаў назіралася ўзмоцненае афарбоўванне мембраны на β-катэнін (W, X) і E-кадгерын (Y, Z).(AA-BB) Электронная мікрафатаграфія ўчастка эмбрыёна дзікага тыпу, якая выглядае за мяжой апікальна-базальнай клеткі, паказвае выразную электроннашчыльную вобласць, якая сведчыць аб адгезійных злучэннях (AA, стрэлкі).Наадварот, у зрэзах эмбрыёнаў-мутантаў Specc11 (BB, стрэлкі) усё апікабазальнае злучэнне з'яўляецца электронна-шчыльным, што паказвае на павышаную шчыльнасць і дысперсію адгезійных злучэнняў.
Каб праверыць нашу гіпотэзу аб тым, што памяншэнне напластавання адбываецца з-за змененага AJ, мы вывучылі маркіроўку AJ у адкрытых нервовых зморшчынах Specc1l-мутантных эмбрыёнаў (мал. 5S-Z).Мы назіралі павелічэнне валокнаў актыну стрэсу (мал. 5S, T) і спадарожную павелічэнне лакалізацыі афарбоўвання міязіну IIB на валокнах актыну (мал. 5U, V).Важна адзначыць, што мы назіралі павелічэнне афарбоўвання β-катенина (мал. 5W, X) і E-кадгерина (мал. 5Y, Z) на міжклеткавых межах.Мы таксама даследавалі афарбоўванне β-катенином NCC ў нервовых зморшчынах эмбрыёнаў E8.5 (мал. 5K, L).Афарбоўванне β-катенінам аказалася мацнейшым у мутантных нервовых зморшчынах Specc1l (мал. 5L і K), што сведчыць аб тым, што пачаліся змены AJ.На электронных мікрафатаграфіях зрэзаў чэрапа эмбрыёнаў E9.5 мы зноў назіралі павышаную дыфузную электронна-шчыльную афарбоўку ў эмбрыёнаў-мутантаў Specc1l у параўнанні з WT (мал. 5AA, BB і S1E-H).У сукупнасці гэтыя вынікі пацвярджаюць нашы вынікі in vitro ў клетках SPECC1L-kd U2OS і мяркуюць, што аберрантнае афарбоўванне AJ папярэднічае стратыфікацыі CNCC у нашых эмбрыёнах-мутантах.
Улічваючы вядомую антаганістычных ўзаемасувязь паміж актыўнасцю AKT і стабільнасцю Е-кадгерыну,17,28 мы выказалі здагадку аб удзеле перадачы сігналаў PI3K-AKT.Акрамя таго, мы назіралі субэпідэрмальныя бурбалкі ў некаторых з нашых эмбрыёнаў-мутантаў, якія пазбеглі смяротнасці (<5%) на E9,5-10,5 і замест гэтага спыніліся каля E13,5 (мал. S3).Субэпідэрмальныя бурбалкі з'яўляюцца прыкметай паніжанай перадачы сігналу PI3K-AKT на аснове PDGFRα12.Фантауца і інш.(2014) паведамілі, што парушэнне актывацыі PI3K на аснове PDGFRα ў мутантных эмбрыёнах PdgfraPI3K/PI3K прыводзіць да субэпідэрмальных бурбалак, дэфектаў нервовай трубкі і фенатыпаў расколіны неба.Сапраўды, ўзроўні пан-AKT і актыўнага фасфарыляванага Ser473-AKT былі зніжаны in vivo ў мутантных тканінах Specc1l да прыпынку эмбрыёна E9.5 (мал. 6A-D).Зніжэнне ўзроўню фасфарыляванага Ser473-AKT можа быць цалкам звязана са зніжэннем узроўняў пан-AKT in vivo (мал. 6E) і in vitro (мал. 6F).Зніжэнне in vitro назіралася толькі тады, калі клеткі U2OS моцна зліваліся са зменамі формы клетак і шчыльнасці AJ (малюнак 6D).Такім чынам, нашы дадзеныя сведчаць аб тым, што SPECC1L з'яўляецца новым станоўчым рэгулятарам перадачы сігналаў PI3K-AKT у чэрапна-тварным марфагенезе.
(A–E) E8.5 (A, B) і E9.5 (C, D) зрэзы чэрапа або E9.5 лізаты з эмбрыёнаў-мутантаў Specc1l (E), якія дэманструюць узровень актыўнага фасфарыляванага S473-AKT і паніжэння колькасці пан-AKT бялку , у параўнанні з кантрольнай WT.Вестэрн-блот праводзілі на лізатах дзікага тыпу і лізатах мутантаў у тых жа ўмовах.Выявы, паказаныя для SPECC1L, былі ўзяты з адной плямы.Тая ж пляма была выдаленая і паўторна даследавана антыцеламі супраць пан-ACT і β-актыну.Узроўні Pan-AKT у нервовых зморшчынах E8.5 (A, B) і ўзроўні фасфарыляванага S473-AKT у зрэзах чэрапа E9.5 былі значна зніжаны.(F) Узроўні Pan-AKT былі аналагічным чынам зніжаны ў лізатах клетак SPECC1L-kd U2OS, сабраных пры высокай зліцці.Палоскі памылак прадстаўляюць SEM з трох незалежных колькасных ацэнак Вестэрн-блот.(GJ) Зрэзы эмбрыёнаў WT на E9.5, афарбаваныя адпаведна KI67 і расшчапленай каспазай 3, якія паказваюць праліферацыю клетак (G, G') і невялікую апоптотическую актыўнасць (H, H').Эмбрыёны-мутанты Specc11 дэманструюць параўнальную праліферацыю клетак (I), але колькасць клетак, якія падвяргаюцца апоптозу, значна павялічваецца (J).
Затым мы вывучылі маркеры праліферацыі і апоптоза.Мы не назіралі ніякай розніцы ў праліферацыі эмбрыёнаў E9.5 (мал. 6E, G у параўнанні з I) з індэксам праліферацыі 82,5% для мутантаў WT і 86,5% для мутантаў Specc1l, вымераным з дапамогай афарбоўвання KI67 (p <0,56, Фішэра). дакладны тэст).Падобным чынам мы не назіралі ніякай розніцы ў апоптозе, вымераным шляхам афарбоўвання расшчапленай каспазы 3 у нервовых зморшчынах на E8.5 да прыпынку эмбрыёна (не паказана) (не паказана).Наадварот, апоптоз быў значна павялічаны ва ўсіх эмбрыёнах-мутантах E9.5 (мал. 6F, H і J).Гэта агульнае павелічэнне апоптозу адпавядае паніжанай перадачы сігналаў PI3K-AKT і ранняй эмбрыянальнай лятальнасці29,30,31.
Далей, каб пацвердзіць прычынную ролю сігналізацыі PI3K-AKT у зменах AJ у нашых клетках kd, мы хімічна змянілі шлях у кантрольных клетках і клетках kd (малюнак 7A-F).Мы выкарыстоўвалі ў якасці маркера фенатып змены формы клеткі, які назіраецца ў канфлюентных клетках SPECC1L-kd, які мы колькасна вызначылі, выкарыстоўваючы стаўленне самага доўгага памеру (даўжыні) да адпаведнага вертыкальнага памеру (шырыні).Каэфіцыент 1 чакаецца для адносна круглых або кубападобных клетак (малюнак 7G).У дадатак да формы клеткі, мы таксама пацвердзілі ўплыў на AJ шляхам афарбоўвання β-катенина (мал. 7A'-F').Інгібіравання шляху PI3K-AKT з дапамогай вортманніну было дастаткова, каб змяніць форму клетак у кантрольных клетках (малюнак 7A,C) і AJ (малюнак 7A').Актыватар PI3K-AKT SC-79 не ўплывае на форму клеткі (мал. 7A, E) або пашырэнне AJ (мал. 7A') у кантрольных клетках.У клетках SPECC1L-kd далейшае падаўленне шляху PI3K-AKT прывяло да ўзмацнення апоптозу (мал. 7B, D) і прыкметнага павелічэння афарбоўвання β-катенінам (мал. 7B'), што адпавядае нашым цяжкім мутантам in vivo.Важна адзначыць, што актывацыя шляху PI3K-AKT значна палепшыла форму клеткі (малюнак 7B, F) і фенатып AJ (малюнак 7B”).Змены ў форме клеткі колькасна вызначалі як каэфіцыент акругласці клеткі (CCR) і параўноўвалі іх значнасць, як апісана вышэй (ФІГ. 7G).Сапраўды, у кантрольных клетках (мал. 7G, CCR = 1,56) апрацоўка вортманнінам была дастатковай, каб значна змяніць форму клеткі (мал. 7G, CCR = 3,61, p <2,4 × 10-9) да ступені, падобнай да назіранай у SPECC1L.-kd клетак (мал. 7G, CCR = 3,46).Лячэнне клеткамі SPECC1L-kd вортманнінам (мал. 7G, CCR = 3,60, нязначна) было не больш значным, чым неапрацаваныя клеткі kd (мал. 7G, CCR = 3,46, нязначна) або апрацаванымі вортманнінам кантрольныя клеткі (мал. 7G)., CCR = 3,46, нязначна) дадаткова ўплывае на падаўжэнне клетак (7G, CCR = 3,61, нязначна).Самае галоўнае, што актыватар SC-79 AKT аднавіў падоўжаны фенатып клетак SPECC1L-kd (мал. 7G, CCR = 1,74, р <6,2 × 10-12).Гэтыя вынікі пацвярджаюць, што SPECC1L рэгулюе сігналізацыю PI3K-AKT, і мяркуюць, што ўмеранае зніжэнне SPECC1L ўплывае на адгезію клетак, у той час як моцнае зніжэнне прыводзіць да апоптозу (мал. 8).
(A–F') Кантрольныя (A, C, E) і SPECC1L-kd (B, D, F) клеткі, апрацаваныя інгібітарам шляху PI3K-AKT вортманнінам (C, D) або актыватарам SC-79 (E, F) Лячэнне Неапрацаваныя кантрольныя клеткі маюць форму куба (A) з нармальным клеткавым афарбоўваннем β-cat (A'), у той час як клеткі kd падоўжаныя (B) з павышаным афарбоўваннем β-cat (B').Пасля падаўлення шляху PI3K-AKT кантрольныя клеткі падоўжыліся (C) з пашырэннем β-cat (C'), у той час як клеткі kd пачалі падвяргацца апоптозу (D), падобна нашым моцна мутаваным эмбрыёнам і дэманструючы надзвычай узмоцнены β-cat.афарбоўка (D').Пасля актывацыі шляху PI3K-AKT кантрольныя клеткі заставаліся кубападобнымі (E) і мелі нармальнае афарбоўванне β-cat (E'), у той час як клеткі kd паказалі значнае паляпшэнне формы клетак (F) і афарбоўвання β-cat (F'), што паказвае на (G) Ступень змены формы клеткі ў (AF) была колькасна вызначана з выкарыстаннем каэфіцыента круглявасці клеткі (CCR) самага доўгага памеру (даўжыні) і адпаведнага вертыкальнага памеру (шырыні) з дапамогай праграмнага забеспячэння MetaMorph.Неапрацаваныя (NT) клеткі SPECC1L-kd (CCR = 3,46) былі значна даўжэй, чым кантрольныя клеткі (CCR = 1,56, p <6,1 × 10–13).Інгібіравання Вортам шляху PI3K-AKT у кантрольных клетках было дастаткова, каб выклікаць падобнае падаўжэнне формы клеткі (CCR=3,61, р<2,4×10-9).Аналагічным чынам актывацыя AKT з дапамогай SC-79 у клетках SPECC1L-kd аднавіла падаўжэнне клетак да кантрольных узроўняў (CCR = 1,74, p <6,2 × 10–12).Апрацоўка клетак SPECC1L-kd вортманнінам прывяла да павелічэння апоптозу, але не да далейшага павелічэння змены формы клетак (CCR=3,60) у параўнанні з неапрацаванымі kd (CCR=3,46, нс) або кантрольнымі клеткамі, апрацаванымі вортманнінам (3,61), якія назіраліся ў.ns = не мае значэння.+/- Паказаны вымярэнні SEM для 50 клетак.Статыстычныя адрозненні разлічвалі з дапамогай t-крытэра Ст'юдэнта.
(A) Схематычнае адлюстраванне інгібіравання і актывацыі шляху PI3K-AKT, што прыводзіць да змяненняў і выратавання AJ адпаведна.(B) Прапанаваная мадэль стабілізацыі бялку AKT з дапамогай SPECC1L.
Премиграционные CNCC патрабуюць лізісу AJ, каб аддзяліцца ад нейроэпителиальных клетак пярэдняй нервовай зморшчыны1,15,32.Падвышанае афарбоўванне кампанентаў AJ і страта апікальна-базальнага асіметрычнага размеркавання AJ у клетках з дэфіцытам SPECC1L як in vitro, так і in vivo ў спалучэнні з фізічнай блізкасцю SPECC1L да β-катеніну сведчаць аб тым, што SPECC1L функцыянуе для належнага падтрымання лакальнай стабільнасці AJ для Арганізацыйныя мышцы.актынавы цыташкілет.Сувязь SPECC1L з актынавым цыташкілетам і β-катенінам і павелічэнне колькасці кандэнсаваных нітак актыну ў адсутнасць SPECC1L супадае з назіраным павелічэннем шчыльнасці AJ.Іншая магчымасць заключаецца ў тым, што павелічэнне колькасці валокнаў актыну ў клетках з дэфіцытам SPECC1L прыводзіць да змены міжклеткавага напружання.Паколькі клеткавы стрэс уплывае на дынаміку AJ 33, змены напружання могуць прывесці да больш дыфузнага AJ 34.Такім чынам, любыя змены паўплываюць на ўзроўні CNCC.
Wnt1 выяўляецца ў ранніх нервовых зморшчынах, якія даюць пачатак клеткам нервовага грэбня.Такім чынам, адсочванне радаводу Wnt1-cre пазначае NCC35 як да, так і да міграцыі.Тым не менш, Wnt1 таксама пазначае клоны дорсальной мазгавой тканіны, таксама атрыманыя з ранніх нервовых зморшчын 35,36, што робіць верагодным тое, што наша афарбоўка мутантаў E9.5 на маркеры Wnt1 у адкрытых нервовых зморшчынах не з'яўляецца CNCC.Наша станоўчае афарбоўванне на маркеры NCC AP2A і SOX10 пацвердзіла, што адкрытыя нервовыя зморшчыны эмбрыёнаў-мутантаў Specc11 сапраўды ўтрымлівалі CNCC.Акрамя таго, паколькі AP2A і SOX10 з'яўляюцца маркерамі ранняй міграцыі NCC, станоўчае афарбоўванне паказала, што гэтыя клеткі з'яўляюцца постміграцыйнымі CNCC, якія не могуць быць стратыфікаваны па E9.5.
Нашы дадзеныя паказваюць, што малекулярная рэгуляцыя AJ з дапамогай SPECC1L апасродкавана сігналізацыяй PI3K-AKT.У клетках і тканінах з дэфіцытам SPECC1L сігналізацыя AKT зніжана.Знаходкі Fantauzzo і інш.падтрымліваюць прамую ролю сігналізацыі PI3K-AKT у чэрапна-тварным марфагенезе.(2014) паказалі, што адсутнасць актывацыі перадачы сігналу PI3K-AKT на аснове PDGFRα прыводзіць да фенатыпу расколіны неба.Мы таксама паказваем, што інгібіравання шляху PI3K-AKT дастаткова для змены AJ і формы клетак у клетках U2OS.У адпаведнасці з нашымі высновамі Cain et al.37 паказалі, што паніжаная рэгуляцыя субадзінак PI3K α110 у эндотелиальных клетках прыводзіць да аналагічнага павелічэння перыцеллюлярнага афарбоўвання β-катенина, што называецца павелічэннем «індэкса злучэння».Аднак у эндотелиальных клетках, чые ніткі актыну ўжо высокаарганізаваныя, падаўленне шляху PI3K-AKT прыводзіць да рыхлай формы клетак.Наадварот, клеткі SPECC1L-kd U2OS паказалі выцягнутую форму клетак.Гэта адрозненне можа быць спецыфічным для тыпу клеткі.У той час як падаўленне перадачы сігналаў PI3K-AKT пастаянна ўплывае на актынавы цыташкілет, уплыў на форму клеткі вызначаецца зменамі напружання, выкліканымі зменамі ў шчыльнасці і арганізацыі цэнтральных актынавых валокнаў.У клетках U2OS мы выкарыстоўвалі толькі змены формы клетак у якасці маркера змены і аднаўлення AJ з дэфіцытам SPECC1L.У заключэнне мы мяркуем, што інгібіраванне шляху AKT пры дэфіцыце SPECC1L павялічвае стабільнасць AJ і памяншае расслаенне ў CNCC.
Цікава, што ўзроўні пан-AKT былі зніжаны in vitro і in vivo ў дадатак да ўзроўню фасфарыляванага 473-AKT у адсутнасць SPECC1L, што сведчыць аб рэгуляванні перадачы сігналаў PI3K-AKT на ўзроўні стабільнасці або абароту бялку AKT.Гены SPECC1L і MID1, абодва звязаныя з сіндромам Opitz/GBBB, кадуюць вавёркі, якія стабілізуюць мікратрубачкі 18,22.Механізм, з дапамогай якога SPECC1L і MID1 забяспечваюць стабілізацыю мікратрубачак, да канца не вывучаны.У выпадку SPECC1L гэтая стабілізацыя ўключае ўзмоцненае ацэтыляванне падгрупы мікратрубачак 18 .Цалкам магчыма, што SPECC1L выкарыстоўвае падобны механізм для стабілізацыі іншых бялкоў, такіх як AKT.Было паказана, што ацэтыляванне рэшткаў лізіну ў бялку АКТ прыводзіць да памяншэння мембраннай лакалізацыі і фасфаралявання38.Акрамя таго, убиквитинирование ланцуга K63 па тым жа астатку лізіну на AKT неабходна для яго мембраннай лакалізацыі і актывацыі39,40.Сярод некалькіх фактараў, якія ўзаемадзейнічаюць з вавёркамі SPECC1L, ідэнтыфікаваных у розных высокапрадукцыйных двухгібрыдных скрынінгах дрожджаў, чатыры - CCDC841, ECM2942, APC і UBE2I43 - былі ўцягнутыя ў абарот або стабільнасць бялку праз убіквітынацыю або сумаілаванне.SPECC1L можа ўдзельнічаць у посттрансляцыйнай мадыфікацыі рэшткаў лізіну AKT, што ўплывае на стабільнасць AKT.Аднак важная роля SPECC1L у лакалізацыі і стабільнасці бялку AKT яшчэ не высветлена.
Сур'ёзныя дэфекты экспрэсіі SPECC1L in vivo прывялі да павелічэння афарбоўвання маркера AJ і дэфектнага накладання CNCC, а таксама да ўзмацнення апоптозу і ранняй эмбрыянальнай смяротнасці.Папярэднія паведамленні паказалі, што мышыныя мутанты з павышаным узроўнем апоптозу звязаны з дэфектамі нервовай трубкі 44, 45, 46, 47 і чэрапна-тварнымі дэфектамі 48.Было выказана здагадка, што празмерная гібель клетак у нервовых зморшчынах або дугах глоткі можа прывесці да недастатковай колькасці клетак, неабходных для належнага морфагенетычнага руху 48,49,50.Наадварот, нашы клетачныя лініі з дэфіцытам SPECC1L з умерана зніжанай экспрэсіяй SPECC1L паказалі толькі змены AJ без прыкмет павелічэння гібелі клетак.Аднак хімічнае інгібіраванне шляху PI3K-AKT у гэтых клетках Kd прывяло да ўзмацнення апоптозу.Такім чынам, умеранае зніжэнне экспрэсіі або функцыі SPECC1L забяспечвае выжыванне клетак.Гэта супадае з назіраннем, што рэдкія эмбрыёны-мутанты Specc11, якія пазбеглі арышту на вул.E9.5 — магчыма, з-за паніжанай эфектыўнасці захопу генаў — здольныя закрываць свае нервовыя трубкі і спыняцца на больш позніх стадыях развіцця, часта з чэрапна-асабовымі дэфектамі (мал. S3).Гэтаму таксама адпавядае рэдкая з'ява гетэразіготных эмбрыёнаў Specc1l з чэрапна-асабовымі анамаліямі - верагодна, з-за павышэння эфектыўнасці захопу генаў - а таксама знаходка ў рыбак даніо, у якой адзін з двух артолагаў SPECC1L (specc1lb) выклікае познія эмбрыянальныя фенатыпы, уключаючы страту ніжнія сківіцы і двухбаковыя расколіны51.Такім чынам, гетерозиготные мутацыі страты функцыі SPECC1L, выяўленыя ў пацыентаў-людзей, могуць выклікаць невялікія парушэнні функцыі SPECC1L падчас чэрапна-тварнага марфагенезу, дастатковыя для тлумачэння іх ротава-асабовых расколін.Рэгуляцыя міжклеткавых кантактаў на аснове SPECC1L таксама можа гуляць пэўную ролю ў палатагенезе і зліцці глоточных дуг.Далейшыя даследаванні функцыі SPECC1L дапамогуць высветліць ролю часовых міжклеткавых кантактаў у CNCC падчас закрыцця нервовай трубкі ў рухомасці нейроэпителиальных клетак і чэрапна-тварным марфагенезе.
Кантроль остеосаркомы U2OS і клеткі SPECC1L-kd былі апісаны раней (Saadi et al., 2011).Антыцелы супраць SPECC1L таксама былі ахарактарызаваны раней (Saadi et al., 2011).Антыцелы да β-катэніну (трус; 1:1000; Санта-Круз, Далас, штат Тэхас) (мышы; 1:1000; Cell Signaling Technology, Дэнверс, Масачусэтс), міязін IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colour.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , Каліфорнія), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), расшчапленая каспаза 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) і β-акцін (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) выкарыстоўваўся, як апісана..Ніткі актыну афарбоўвалі Acti-афарбоўкай родамін-фаллоідынам (Cytoskeleton, Дэнвер, Каларада).
Кантрольныя клеткі U2OS і клеткі SPECC1L-kd культывавалі ў стандартнай DMEM з высокім утрыманнем глюкозы з дадаткам 10% фетальной бычынай сыроваткі (Life Technologies, Карлсбад, Каліфорнія).Для змяненняў AJ 2 х 105 клетак высейвалі на шкло, апрацаванае 0,1% свінога жэлаціну (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) і назіралі за зменамі формы клетак.Клеткі збіралі ў розныя паказаныя моманты часу: праз 4 гадзіны пасля пасева (t = 1), праз 24 гадзіны пасля пасева (t = 2), зліццё без змены формы клеткі (t = 3), змяненне формы клеткі (t = 4) , праз 24 ч пасля змены формы клеткі (t = 5) і праз 48 ч пасля змены формы клеткі (t = 6) (мал. 1, 2, 3).Каб мадуляваць шлях PI3K-AKT, клеткі культывавалі ў паказаных канцэнтрацыях з інгібітарам PI3K-AKT вортманнінам (TOCRIS Biosciences, Мінеапаліс, Мінесота) або актыватарам SC-79 (TOCRIS Biosciences, Мінеапаліс Адамс, Мінесота).Асяроддзе, якое змяшчае хімічныя рэчывы, мянялі штодня.
Пакадравыя запісы рабіліся на жывых кантрольных клетках і клетках KD пры нармальных умовах культывавання, а выявы фазавага кантрасту збіралі кожныя 10 хвілін на працягу 7 дзён.Выявы былі атрыманы з дапамогай інвертаванага мікраскопа Leica DM IRB з камп'ютэрным кіраваннем, абсталяванага механічным столікам і аб'ектывам 10 × N-PLAN, падлучаным да камеры QImaging Retiga-SRV.Падчас візуалізацыі культуры клетак падтрымлівалі пры тэмпературы 37°C у вільготнай атмасферы з 5% CO2.
Дзве клетачныя лініі ES генных пастак DTM096 і RRH048 з Рэгіянальнага цэнтра рэсурсаў мутантаў мышэй (UC Davis, Каліфорнія) былі выкарыстаны для стварэння ліній мышэй з дэфіцытам Specc11, пазначаных Specc1lgtDTM096 і Specc1lgtRRH046.Коратка, клеткі 129/REJ ES былі ўведзены ў бластацысты C57BL6.Атрыманых химерных мышэй-самцоў разводзілі з самкамі мышэй C57BL6 для ідэнтыфікацыі нашчадкаў з афарбоўкай поўсці агуці.Для ідэнтыфікацыі гетэразігот выкарыстоўвалася наяўнасць вектарных уставак генных пастак.Мышэй трымалі на змешаным фоне 129/REJ; C57BL6.Размяшчэнне месца ўстаўкі вектара генетычнай пасткі было пацверджана RT-PCR, секвенированием геному і генетычнай камплементацыі (дадатковы малюнак 1).Каб прасачыць лінію CNCC падвойных гетэразіготных мышэй Specc1lGT, мышэй ROSAmTmG (#007576) і Wnt1-Cre (#003829) (Лабараторыя Джэксана, Бар-Харбар, Мэн) скрыжавалі для атрымання алеляў ROSAmTmG і Wnt1-Cre у мутантавых эмбрыёнах Specc1l.Усе эксперыменты на мышах праводзіліся ў адпаведнасці з пратаколамі, зацверджанымі Інстытуцыйным камітэтам па доглядзе і выкарыстанні жывёл Медыцынскага цэнтра Універсітэта Канзаса.
Эмбрыёны фіксавалі ў (1% фармальдэгід, 0,2% глутаровый альдэгід, 2 мМ MgCl2, 0,02% NP-40, 5 мМ EGTA) на працягу 60 хвілін пры пакаёвай тэмпературы.Пасля фіксацыі ў растворы для афарбоўвання X-gal (5 ммоль феррицианида калія, 5 ммоль феррацыяніду калія, 2 ммоль MgCl2, 0,01% дэзаксіхалату натрыю, 0,02% NP-40, 1 мг/мл X-gal) Праяўка афарбоўкі праводзілася пры 37°C. .°C на працягу 1-6 гадзін.Эмбрыёны постфиксировали ў 4% PFA і візуалізавалі.
Для вестэрн-блоттинга клеткі лізіравалі ў буферы для пасіўнага лізісу (Promega, Fitchburg, WI), дапоўненым сумессю інгібітараў пратэазы HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Лізаты апрацоўвалі на гатовых гелях з 12% поліакрыламіду Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad, Hercules, CA) і пераносілі на мембраны Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).Мембраны былі заблакаваныя ў 5% малака ў PBS, які змяшчае 0,1% Tween.Антыцелы інкубавалі на працягу ночы пры 4°C або на працягу адной гадзіны пры пакаёвай тэмпературы.Для генерацыі сігналу выкарыстоўваўся рэагент Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA).Для імуннага афарбоўвання эмбрыёны фіксавалі на ноч у 4% PFA/PBS і крыякансервавалі.Крыясрэзы тканін блакавалі ў PBS, які змяшчае 1% нармальнай казінай сыроваткі (Thermo Scientific, Waltham, MA) і 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), а затым інкубавалі пры 4°C у інкубатары на працягу ноч.з антыцеламі і флуарэсцэнтнымі другаснымі антыцеламі (1:1000) на працягу 1 гадзіны пры 4°C.Афарбаваныя зрэзы змяшчалі ў залатую сераду ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) і плоскія выявы атрымлівалі з дапамогай канфакальнага мікраскопа Leica TCS SPE.Кожнае імуннае афарбоўванне выконвалася ў выглядзе трох незалежных эксперыментаў на цырасекцыях як мінімум двух эмбрыёнаў-мутантаў.Паказаны рэпрэзентатыўны эксперымент.
Клеткі інкубавалі ў мадыфікаваным буферы RIPA (20 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 1% NP-40, 130 мМ NaCl, 10% гліцэрыны, 2 мМ EDTA і інгібітар пратэазы HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Карацей кажучы, лізаты былі папярэдне ачышчаны з дапамогай магнітных шарыкаў бялку G (Life Technologies, Карлсбад, Каліфорнія), а затым інкубаваны на працягу ночы пры 4°C з анты-SPECC1L або IgG. Антыцелы -β-катэнін, апісаныя вышэй. Прадэманстраваныя эксперыменты сумеснага ІП з'яўляюцца прадстаўнікамі чатырох незалежных эксперыментаў.
Фіксаваныя культывуюцца клеткі або эмбрыянальныя тканіны мышэй былі прадастаўлены ў цэнтр электроннай мікраскапіі ў Медыцынскім цэнтры Універсітэта Канзаса.Карацей кажучы, узоры залівалі ў смалу EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Форт-Вашынгтон, Пенсільванія), палімерызавалі на працягу ночы пры 60°C і разразалі пры 80 нм з дапамогай ультрамікратома Leica UC7, абсталяванага алмазным лязом.Зрэзы візуалізавалі з дапамогай трансмісійнага электроннага мікраскопа JEOL JEM-1400, абсталяванага гарматай Lab6 на 100 кВ.
Як цытаваць гэты артыкул: Wilson, NR et al.Дэфіцыт SPECC1L прыводзіць да павышэння стабільнасці зрошчаных суставаў і памяншэння расслаення клетак чэрапна-нервовага грэбня.навука.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Сен-Жан, Ж.-П.Індукцыя і дыферэнцыявання нервовага грэбня.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR і інш.Клеткі чэрапнага нервовага грэбня ў руху: іх роля ў чэрапна-асабовым развіцці.Амерыканскі часопіс медыцынскай генетыкі.Частка A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: яе рост і развіццё на працягу 20 гадоў.педыятр.паталогіі.лабараторыя.лекі.17, 1–25 (1997).
Мангольд Э., Людвіг КУ і Нотэн М.М. Прарыў у генетыцы ротава-асабовых расколін.Тэндэнцыі ў малекулярнай медыцыне 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Міну, М. і Райлі, Ф. М. Малекулярныя механізмы міграцыі клетак чэрапна-нервовага грэбня і патэрнаў падчас чэрапна-асабовага развіцця.Распрацоўка 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Дыксан, MJ, Маразіта, ML, Біці, TH і Мюрэй, JK.натуральны каментар.Генетыка 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR і інш.Анамальны морфогенез скуры, канечнасцяў і чэрапна-асабовай вобласці ў інтэрферон-рэгулюе фактару-6 (Irf6) -дэфіцытных мышэй.Нацыянальны Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Пейрар-Жанвід, М. і інш.Дамінантныя мутацыі ў GRHL3 выклікаюць сіндром Ван дэр Ваорда і пагаршаюць развіццё перыдэрмы паражніны рота.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Харыс, MJ і Juriloff, DM Абнаўленне спісу мышыных мутантаў з дэфектамі ў закрыцці нервовай трубкі і прасоўванне да поўнага генетычнага разумення закрыцця нервовай трубкі.Даследаванне прыроджаных дэфектаў.Частка A, Клінічная і малекулярная тэраталогія 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-апасродкаваная сігналізацыя PDGFRalpha рэгулюе выжыванне і праліферацыі ў развіцці шкілета праз p53-залежны ўнутрыклетачны шлях.Развіццё генаў 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND і Murdoch, JN Rasheveled: Адносіны канвергентнага пашырэння да закрыцця нервовай трубкі.Тэндэнцыі ў неўралогіі.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).