Дзякуй за наведванне Nature.com.Вы выкарыстоўваеце версію браўзера з абмежаванай падтрымкай CSS.Для найлепшага вопыту мы рэкамендуем вам выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer).Акрамя таго, каб забяспечыць пастаянную падтрымку, мы паказваем сайт без стыляў і JavaScript.
Паўзункі, якія паказваюць тры артыкулы на слайдзе.Для перамяшчэння па слайдах выкарыстоўвайце кнопкі "Назад" і "Далей" або кнопкі кантролера слайдаў у канцы для перамяшчэння па кожным слайдзе.

Пастаўшчыкі спіральных труб з нержавеючай сталі 317

Табліца хімічнага складу матэрыялу з нержавеючай сталі

SPACA6 - гэта павярхоўны бялок, які экспрэсуецца ў сперме і мае вырашальнае значэнне для зліцця гамет падчас палавога размнажэння млекакормячых.Нягледзячы на ​​​​гэтую фундаментальную ролю, канкрэтная функцыя SPACA6 недастаткова вывучана.Мы высвятляем крышталічную структуру пазаклеткавага дамена SPACA6 з дазволам 2,2 Å, выяўляючы бялок з двума даменамі, які складаецца з чатырохланцуговага пучка і Ig-падобных β-сэндвічаў, злучаных квазігнуткімі лінкерамі.Гэтая структура нагадвае IZUMO1, іншы бялок, звязаны са зліццём гамет, што робіць SPACA6 і IZUMO1 членамі-заснавальнікамі суперсямейства бялкоў, звязаных з апладненнем, якое тут называецца суперсямействам IST.Надсямейства IST структурна вызначаецца яго скручаным пучком з чатырох спіралей і парай дысульфідна звязаных матываў CXXC.Пошук пратэома чалавека на аснове структуры AlphaFold выявіў дадатковыя бялковыя члены гэтага надсямейства;характэрна, што многія з гэтых бялкоў ўдзельнічаюць у зліцці гамет.Структура SPACA6 і яе ўзаемаадносіны з іншымі членамі надсямейства IST забяспечваюць адсутнае звяно ў нашых ведах аб зліцці палавых клетак млекакормячых.
Жыццё кожнага чалавека пачынаецца з дзвюх асобных гаплоідных гамет: спермы бацькі і яйкаклеткі маці.Гэты народак з'яўляецца пераможцам інтэнсіўнага працэсу адбору, падчас якога мільёны народкаў праходзяць праз жаночыя палавыя шляхі, пераадольваюць розныя перашкоды1 і падвяргаюцца капацытацыі, што ўзмацняе іх рухомасць і працэс паверхневых кампанентаў2,3,4.Нават калі народак і ооцит знаходзяць адзін аднаго, працэс яшчэ не скончаны.Яйкаклетка акружана пластом кумулюсных клетак і глікапратэінавым бар'ерам, які называецца зона pellucida, праз якую сперма павінна прайсці, каб патрапіць у яйкаклетку.Сперматазоіды выкарыстоўваюць камбінацыю малекул павярхоўнай адгезіі і звязаных з мембранай і сакрэтаваных ферментаў, каб пераадолець гэтыя канчатковыя бар'еры5.Гэтыя малекулы і ферменты ў асноўным захоўваюцца ва ўнутранай мембране і акрасомальнай матрыцы і выяўляюцца, калі знешняя мембрана народка лізуецца падчас акрасомальнай рэакцыі6.Апошнім крокам у гэтым інтэнсіўным падарожжы з'яўляецца падзея зліцця народка і яйкаклеткі, падчас якой дзве клеткі зліваюць свае мембраны, каб стаць адзіным дыплоідным арганізмам7.Хоць гэты працэс з'яўляецца наватарскім у рэпрадукцыі чалавека, неабходныя малекулярныя ўзаемадзеяння недастаткова вывучаны.
У дадатак да апладнення палавых клетак шырока даследаваўся хімічны працэс зліцця двух ліпідных біслояў.Увогуле, зліццё мембран - гэта энергетычна неспрыяльны працэс, які патрабуе ад бялковага каталізатара структурнай змены канфармацыі, якая збліжае дзве мембраны, парушаючы іх бесперапыннасць і выклікаючы зліццё8,9.Гэтыя бялковыя каталізатары вядомыя як фузагены і былі знойдзены ў незлічоных тэрмаядзерных сістэмах.Яны неабходны для пранікнення віруса ў клеткі гаспадара (напрыклад, gp160 у ВІЧ-1, усплёск каранавірусаў, гемагглюцінін у вірусах грыпу)10,11,12 плацентарный (сінцытын)13,14,15 і зліццё гамет у ніжэйшых эукарыёт ( HAP2/GCS1 у раслін, пратыстаў і членістаногіх) 16,17,18,19.Фузагены для палавых клетак чалавека яшчэ не знойдзены, хоць было паказана, што некалькі бялкоў маюць вырашальнае значэнне для прымацавання і зліцця гамет.CD9, які экспрэсуецца ў ооцитах, трансмембранный бялок, неабходны для зліцця палавых клетак мышы і чалавека, быў першым знойдзены 21,22,23.Нягледзячы на ​​тое, што яго дакладная функцыя застаецца незразумелай, яго роля ў адгезіі, структуры ачагоў адгезіі на микроворсинках яйкі і/або правільнай лакалізацыі паверхневых бялкоў яйкаклеткі здаецца верагоднай 24,25,26.Двума найбольш тыповымі вавёркамі, якія маюць вырашальнае значэнне для зліцця гамет, з'яўляюцца бялок спермы IZUMO127 і бялок яйкаклеткі JUNO28, і іх узаемная асацыяцыя з'яўляецца важным крокам у распазнаванні і адгезіі гамет да зліцця.Самцы мышэй з накаўтам Izumo1 і самкі мышэй з накаўтам Juno цалкам стэрыльныя, у гэтых мадэлях сперма трапляе ў перывітэлінавую прастору, але гаметы не зліваюцца.Аналагічным чынам зліццё было паменшана, калі гаметы апрацоўвалі антыцеламі супраць IZUMO1 або JUNO27,29 у эксперыментах па апладненні чалавека in vitro.
Нядаўна была выяўлена новая група бялкоў, якія экспрэсуюць сперму, фенатыпічна падобныя на IZUMO1 і JUNO20,30,31,32,33,34,35.У буйнамаштабным даследаванні мутагенезу на мышах бялок 6, звязаны з акрасомальнай мембранай спермы (SPACA6), быў ідэнтыфікаваны як важны для апладнення.Устаўка трансгена ў ген Spaca6 стварае неплаўныя народкі, хоць гэтыя народкі пранікаюць у перывітэліннае прастору 36 .Наступныя даследаванні накаўту на мышах пацвердзілі, што Spaca6 неабходны для зліцця гамет 30,32.SPACA6 экспрэсуецца амаль выключна ў яечках і мае патэрн лакалізацыі, падобны да IZUMO1, а менавіта ў інтыме сперматазоіда да акрасомальнай рэакцыі, а затым мігруе ў экватарыяльную вобласць пасля акрасомальнай рэакцыі 30,32.Гамолагі Spaca6 існуюць у розных млекакормячых і іншых эукарыёт 30 , і іх важнасць для зліцця палавых клетак чалавека была прадэманстравана інгібіраваннем апладнення чалавека in vitro праз устойлівасць да SPACA6 30 .У адрозненне ад IZUMO1 і JUNO, дэталі структуры, узаемадзеяння і функцыі SPACA6 застаюцца незразумелымі.
Каб лепш зразумець фундаментальны працэс, які ляжыць у аснове зліцця чалавечай спермы і яйкаклеткі, што дазволіць нам інфармаваць будучыя распрацоўкі ў галіне планавання сям'і і лячэння фертыльнасці, мы правялі структурныя і біяхімічныя даследаванні SPACA6.Крышталічная структура пазаклеткавага дамена SPACA6 дэманструе чатырохспіральны пучок (4HB) і імунаглабулінападобны (Ig-падобны) дамен, злучаны квазігнуткімі ўчасткамі.Як было прадказана ў папярэдніх даследаваннях7,32,37, даменная структура SPACA6 падобная на даменную структуру IZUMO1 чалавека, і два бялкі маюць незвычайны матыў: 4HB з трохкутнай спіральнай паверхняй і парай дысульфідна звязаных матываў CXXC.Мы мяркуем, што IZUMO1 і SPACA6 цяпер вызначаюць большае, структурна звязанае суперсямейства бялкоў, звязаных са зліццём гамет.Выкарыстоўваючы асаблівасці, унікальныя для звышсямейства, мы правялі вычарпальны пошук структурнага пратэома чалавека AlphaFold, вызначыўшы дадатковых членаў гэтага звышсямейства, у тым ліку некалькіх членаў, якія ўдзельнічаюць у зліцці гамет і/або апладненні.Цяпер аказалася, што існуе агульная структурная зморшчына і суперсямейства бялкоў, звязаных са зліццём гамет, і наша структура дае малекулярную карту гэтага важнага аспекту механізму зліцця гамет чалавека.
SPACA6 - гэта трансмембранны бялок за адзін праход з адным N-звязаным гліканам і шасцю меркаванымі дысульфіднымі сувязямі (малюнкі S1a і S2).Мы выказалі пазаклеткавай дамен чалавечага SPACA6 (рэшткі 27-246) у клетках дразафілы S2 і ачысцілі бялок з дапамогай сродства да нікеля, катыённага абмену і эксклюзійнай храматаграфіі (мал. S1b).Вычышчаны эктадамен SPACA6 вельмі стабільны і аднастайны.Аналіз з выкарыстаннем эксклюзійнай храматаграфіі ў спалучэнні з паліганальным рассейваннем святла (SEC-MALS) выявіў адзін пік з разліковай малекулярнай масай 26,2 ± 0,5 кДа (мал. S1c).Гэта адпавядае памеру манамернага эктадамена SPACA6, што паказвае на тое, што падчас ачысткі не адбылося алігамерызацыі.Акрамя таго, спектраскапія кругавога дыхраізму (CD) выявіла змешаную α/β структуру з тэмпературай плаўлення 51,3 °C (мал. S1d,e).Дэканвалюцыя спектраў CD выявіла 38,6% α-спіральных і 15,8% β-ланцуговых элементаў (малюнак S1d).
Эктадамен SPACA6 быў выкрышталізаваны з выкарыстаннем выпадковага матрычнага пасева38, у выніку чаго атрымаўся набор дадзеных з дазволам 2,2 Å (табліца 1 і малюнак S3).Выкарыстоўваючы камбінацыю малекулярнага замяшчэння на аснове фрагментаў і фазавых дадзеных SAD з уздзеяннем браміду для вызначэння структуры (табліца 1 і малюнак S4), канчатковая ўдакладненая мадэль складаецца з астаткаў 27–246.На момант вызначэння структуры не было даступных эксперыментальных структур або структур AlphaFold.Эктадамен SPACA6 мае памеры 20 Å × 20 Å × 85 Å, складаецца з сямі спіраляў і дзевяці β-нітак і мае падоўжаную трацічную зморшчыну, стабілізаваную шасцю дысульфіднымі сувязямі (мал. 1а, б).Слабая электронная шчыльнасць на канцы бакавога ланцуга Asn243 паказвае, што гэты астатак з'яўляецца N-звязаным гліказіляваннем.Структура складаецца з двух даменаў: N-канцавога чатырохспіральнага пучка (4HB) і C-канцавога Ig-падобнага дамена з прамежкавай шарнірнай вобласцю паміж імі (мал. 1с).
a Структура пазаклеткавага дамена SPACA6.Паласавая дыяграма пазаклеткавага дамена SPACA6, колер ланцуга ад N да C-канца ад цёмна-сіняга да цёмна-чырвонага.Цыстэіны, якія ўдзельнічаюць у дысульфідных сувязях, вылучаны пурпурным колерам.b Тапалогія пазаклеткавага дамена SPACA6.Выкарыстоўвайце тую ж каляровую схему, што і на малюнку 1а.c пазаклеткавы дамен SPACA6.Дыяграмы палосак 4HB, шарніра і Ig-падобных даменаў афарбаваны адпаведна ў аранжавы, зялёны і сіні колеры.Пласты не намаляваны ў маштабе.
Дамен 4HB SPACA6 уключае чатыры асноўныя спіралі (спіралі 1-4), якія размешчаны ў выглядзе спіралі (мал. 2а), якія чаргуюцца паміж антыпаралельнымі і паралельнымі ўзаемадзеяннямі (мал. 2б).Невялікая дадатковая аднавітковая спіраль (спіраль 1′) пракладзена перпендыкулярна пучку, утвараючы трохкутнік са спіралямі 1 і 2. Гэты трохкутнік злёгку дэфармаваны ў спіральна-закручанай ўпакоўцы адносна шчыльнай упакоўкі спіраляў 3 і 4 ( Мал. 2а).
Дыяграма 4HB N-тэрмінальнай паласы.b Выгляд зверху пучка з чатырох спіраляў, кожная спіраль вылучана цёмна-сінім на N-канцы і цёмна-чырвоным на С-канцы.c Дыяграма спіральнага кола зверху ўніз для 4HB, з кожным астаткам, паказаным у выглядзе круга, пазначанага адналітарным кодам амінакіслоты;толькі чатыры амінакіслоты ў верхняй частцы кола пранумараваны.Непалярныя астаткі пафарбаваны ў жоўты колер, палярныя незараджаныя астаткі афарбаваны ў зялёны колер, станоўча зараджаныя астаткі афарбаваны ў сіні колер, а адмоўна зараджаныя астаткі афарбаваны ў чырвоны колер.d Трохкутныя грані вобласці 4HB з аранжавымі 4HB і зялёнымі завесамі.Абедзве ўстаўкі паказваюць палачкападобныя дысульфідныя сувязі.
4HB сканцэнтраваны на ўнутраным гідрафобным ядры, якое складаецца ў асноўным з аліфатычных і араматычных рэшткаў (мал. 2c).Ядро змяшчае дысульфідную сувязь паміж Cys41 і Cys55, якая злучае спіралі 1 і 2 разам у верхні трохкутнік (мал. 2d).Дзве дадатковыя дысульфідныя сувязі ўтварыліся паміж матывам CXXC у Helix 1 'і іншым матывам CXXC, знойдзеным на кончыку β-шпількі ў шарнірнай вобласці (мал. 2d).Кансерватыўны астатак аргініна з невядомай функцыяй (Arg37) знаходзіцца ўнутры полага трохвугольніка, утворанага спіралямі 1′, 1 і 2. Аліфатычныя атамы вугляроду Cβ, Cγ і Cδ Arg37 узаемадзейнічаюць з гідрафобным ядром, і яго гуанідынавыя групы цыклічна перамяшчаюцца паміж спіралямі 1 'і 1 праз узаемадзеянне паміж касцяком Thr32 і бакавой ланцугом (мал. S5a, b).Tyr34 распаўсюджваецца ў паражніну, пакідаючы дзве невялікія паражніны, праз якія Arg37 можа ўзаемадзейнічаць з растваральнікам.
Ig-падобныя β-сэндвіч-дамены - гэта вялікае суперсямейства бялкоў, якія маюць агульную рысу двух або больш шматланцуговых амфіпатычных β-лістоў, якія ўзаемадзейнічаюць праз гідрафобнае ядро ​​39. С-канцавы Ig-падобны дамен SPACA6 мае тую ж карціну і складаецца з двух слаёў (мал. S6a).Ліст 1 - гэта β-ліст з чатырох нітак (нітак D, F, H і I), дзе ніткі F, H і I утвараюць антыпаралельнае размяшчэнне, а ніткі I і D паралельна ўзаемадзейнічаюць.Табліца 2 - невялікі антыпаралельны двухланцуговы бэта-ліст (ніткі E і G).Унутраная дисульфидная сувязь назіралася паміж С-канцом ланцуга Е і цэнтрам ланцуга Н (Cys170-Cys226) (мал. S6b).Гэтая дысульфідная сувязь аналагічная дысульфіднай сувязі ў β-сэндвіч-дамене імунаглабуліну40,41.
Чатырохжыльны β-ліст закручваецца па ўсёй даўжыні, утвараючы асіметрычныя краю, якія адрозніваюцца формай і электрастатычнасцю.Больш тонкі край - гэта плоская гідрафобная паверхня навакольнага асяроддзя, якая вылучаецца ў параўнанні з астатнімі няроўнымі і электрастатычна рознымі паверхнямі ў SPACA6 (мал. S6b,c).Арэол адкрытых асноўных карбанільных/амінагруп і палярных бакавых ланцугоў акружае гідрафобную паверхню (мал. S6c).Шырокі край пакрыты закрытым спіральным сегментам, які блакуе N-канцавую частку гідрафобнага ядра і ўтварае тры вадародныя сувязі з адкрытай палярнай групай асновы ланцуга F (мал. S6d).С-канцавая частка гэтага краю ўтварае вялікую кішэню з часткова адкрытым гідрафобным ядром.Кішэнь акружана станоўчымі зарадамі з-за трох набораў падвойных рэшткаў аргініна (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 і Arg212-Arg214) і цэнтральнага гістыдыну (His220) (малюнак S6e).
Шарнірная вобласць - гэта кароткі сегмент паміж спіральным даменам і Ig-падобным даменам, які складаецца з аднаго антыпаралельнага трохланцуговага β-слоя (ніткі A, B і C), невялікай спіралі 310 і некалькіх доўгіх выпадковых спіральных сегментаў.(Мал. S7).Сетка кавалентных і электрастатычных кантактаў у шарнірнай вобласці, здаецца, стабілізуе арыентацыю паміж 4HB і Ig-падобным даменам.Сетку можна падзяліць на тры часткі.Першая частка ўключае два матывы CXXC (27CXXC30 і 139CXXC142), якія ўтвараюць пару дысульфідных сувязей паміж β-шпількай у шарніры і спіраллю 1′ у 4HB.Другая частка ўключае электрастатычныя ўзаемадзеяння паміж Ig-падобным даменам і шарнірам.Glu132 у шарніры ўтварае солевы мост з Arg233 у Ig-падобным дамене і Arg135 у шарніры.Трэцяя частка ўключае кавалентнай сувязь паміж Ig-падобным даменам і шарнірнай вобласцю.Дзве дысульфідныя сувязі (Cys124-Cys147 і Cys128-Cys153) злучаюць шарнірную пятлю з лінкерам, які стабілізуецца электрастатычным узаемадзеяннем паміж Gln131 і асноўнай функцыянальнай групай, што дазваляе атрымаць доступ да першага Ig-падобнага дамена.ланцуг.
Структура эктодомена SPACA6 і асобныя структуры 4HB і Ig-падобных даменаў выкарыстоўваліся для пошуку структурна падобных запісаў у бялковых базах дадзеных 42 .Мы вызначылі супадзенні з высокімі баламі Dali Z, малымі стандартнымі адхіленнямі і вялікімі баламі LALI (апошняе ўяўляе сабой колькасць структурна эквівалентных астаткаў).У той час як першыя 10 хітоў з поўнага пошуку эктадамена (табліца S1) мелі прымальны Z-бал >842, пошук толькі па 4HB або Ig-падобным дамене паказаў, што большасць з гэтых хітоў адпавядаюць толькі β-сэндвічам.паўсюдная зморшчына, якая сустракаецца ў многіх бялках.Усе тры пошукі ў Dali далі толькі адзін вынік: IZUMO1.
Даўно выказвалася меркаванне, што SPACA6 і IZUMO1 маюць структурнае падабенства7,32,37.Хаця эктадамены гэтых двух бялкоў, звязаных са зліццём гамет, маюць толькі 21% ідэнтычнасці паслядоўнасці (малюнак S8a), складаныя доказы, у тым ліку кансерватыўны ўзор дысульфіднай сувязі і прадказаны C-канцавы Ig-падобны дамен у SPACA6, дазволілі раннія спробы пабудаваць Гамалагічная мадэль мышы A і SPACA6 з выкарыстаннем IZUMO1 у якасці шаблону37.Наша структура пацвярджае гэтыя прагнозы і паказвае сапраўдную ступень падабенства.Фактычна, структуры SPACA6 і IZUMO137,43,44 маюць аднолькавую архітэктуру з двума даменамі (мал. S8b) з аналагічнымі 4HB і Ig-падобнымі β-сэндвіч-даменамі, злучанымі шарнірнай вобласцю (мал. S8c).
IZUMO1 і SPACA6 4HB маюць агульныя адрозненні ад звычайных спіральных пучкоў.Тыповыя 4HB, такія як тыя, якія знаходзяцца ў бялковых комплексах SNARE, якія ўдзельнічаюць у эндасомальным зліцці 45, 46, маюць раўнамерна размешчаныя спіралі, якія падтрымліваюць пастаянную крывізну вакол цэнтральнай восі 47. У адрозненне ад гэтага, спіральныя дамены ў IZUMO1 і SPACA6 былі скажоныя, са зменнай крывізной і няроўная ўпакоўка (малюнак S8d).Паварот, верагодна, выкліканы трохвугольнікам, утвораным спіралямі 1', 1 і 2, захоўваецца ў IZUMO1 і SPACA6 і стабілізуецца тым жа матывам CXXC на спіралі 1'.Аднак дадатковая дысульфідная сувязь, выяўленая ў SPACA6 (Cys41 і Cys55 кавалентна звязваюць спіралі 1 і 2 вышэй), стварае больш вострую вяршыню на вяршыні трохвугольніка, што робіць SPACA6 больш скручаным, чым IZUMO1, з больш выяўленымі трыкутнікамі паражнін.Акрамя таго, у IZUMO1 адсутнічае Arg37, які назіраецца ў цэнтры гэтай паражніны ў SPACA6.Наадварот, IZUMO1 мае больш тыповае гідрафобнае ядро ​​з аліфатычных і араматычных рэшткаў.
IZUMO1 мае Ig-падобны дамен, які складаецца з двухцепочечного і пятицепочечного β-ліста43.Дадатковая нітка ў IZUMO1 замяняе катушку ў SPACA6, якая ўзаемадзейнічае з ніткай F, каб абмежаваць магістральныя вадародныя сувязі ў нітцы.Цікавым пунктам параўнання з'яўляецца прадказаны павярхоўны зарад Ig-падобных даменаў двух бялкоў.Паверхня IZUMO1 зараджана больш адмоўна, чым паверхня SPACA6.Дадатковы зарад размешчаны каля С-канца, звернутага да мембраны спермы.У SPACA6 тыя ж рэгіёны былі больш нейтральнымі або станоўча зараджанымі (мал. S8e).Напрыклад, гідрафобная паверхня (больш тонкія краю) і станоўча зараджаныя ямкі (больш шырокія краю) у SPACA6 зараджаныя адмоўна ў IZUMO1.
Хоць ўзаемасувязь і элементы другаснай структуры паміж IZUMO1 і SPACA6 добра захаваліся, структурнае выраўноўванне Ig-падобных даменаў паказала, што гэтыя два дамена адрозніваюцца па сваёй агульнай арыентацыі адносна адзін аднаго (мал. S9).Спіральны пучок IZUMO1 выгнуты вакол β-сэндвіча, ствараючы апісаную раней форму "бумеранга" прыкладна пад 50° ад цэнтральнай восі.Наадварот, спіральны прамень у SPACA6 быў нахілены прыкладна на 10° у процілеглы бок.Адрозненні ў гэтых арыентацыях, верагодна, звязаны з розніцай у шарнірнай вобласці.На першасным узроўні паслядоўнасці IZUMO1 і SPACA6 маюць невялікае падабенства паслядоўнасці на шарніры, за выключэннем рэшткаў цыстэіну, гліцыну і аспарагінавай кіслаты.У выніку вадародныя сувязі і электрастатычныя сеткі абсалютна розныя.Элементы другаснай структуры β-ліста агульныя для IZUMO1 і SPACA6, хоць ланцужкі ў IZUMO1 значна даўжэйшыя, а спіраль 310 (спіраль 5) унікальная для SPACA6.Гэтыя адрозненні прыводзяць да розных арыентацый дамена для двух падобных бялкоў.
Наш пошук на серверы Dali паказаў, што SPACA6 і IZUMO1 з'яўляюцца адзінымі дзвюма эксперыментальна вызначанымі структурамі, якія захоўваюцца ў базе даных бялку і маюць менавіта гэты складок 4HB (табліца S1).Зусім нядаўна DeepMind (Alphabet/Google) распрацавала AlphaFold, сістэму на аснове нейроннай сеткі, якая можа дакладна прадказваць 3D-структуры бялкоў па першасных паслядоўнасцях48.Неўзабаве пасля таго, як мы разгадалі структуру SPACA6, была выпушчана база дадзеных AlphaFold, якая забяспечвае прагназуючыя мадэлі структуры, якія ахопліваюць 98,5% усіх бялкоў у пратэоме чалавека48,49.Выкарыстоўваючы нашу вырашаную структуру SPACA6 у якасці мадэлі пошуку, пошук структурнай гамалогіі для мадэлі ў пратэоме чалавека AlphaFold выявіў кандыдатаў з магчымым структурным падабенствам да SPACA6 і IZUMO1.Улічваючы неверагодную дакладнасць AlphaFold у прагназаванні SPACA6 (мал. S10a) — асабліва эктадамен 1,1 Å сярэдняя квадратура ў параўнанні з нашай дазволенай структурай (мал. S10b) — мы можам быць упэўнены, што ідэнтыфікаваныя супадзенні SPACA6, верагодна, будуць дакладнымі.
Раней PSI-BLAST шукаў кластар IZUMO1 з трыма іншымі бялкамі, звязанымі са спермай: IZUMO2, IZUMO3 і IZUMO450.AlphaFold прадказаў, што гэтыя вавёркі сямейства IZUMO згортваюцца ў дамен 4HB з такой жа карцінай дысульфіднай сувязі, што і ў IZUMO1 (малюнкі 3a і S11), хаця ў іх адсутнічае Ig-падобны дамен.Існуе гіпотэза, што IZUMO2 і IZUMO3 - аднабаковыя мембранныя вавёркі, падобныя на IZUMO1, у той час як IZUMO4, здаецца, сакрэтуюць.Функцыі бялкоў IZUMO 2, 3 і 4 пры зліцці гамет не вызначаны.Вядома, што IZUMO3 гуляе ролю ў біягенезе акросом падчас развіцця народкаў51, а бялок IZUMO ўтварае комплекс50.Захаванне бялкоў IZUMO ў млекакормячых, рэптылій і амфібій сведчыць аб тым, што іх патэнцыйная функцыя супадае з функцыяй іншых вядомых бялкоў, звязаных са зліццём гамет, такіх як DCST1/2, SOF1 і FIMP.
Схема даменнай архітэктуры суперсямейства IST з 4HB, шарнірам і Ig-падобнымі даменамі, вылучанымі адпаведна аранжавым, зялёным і сінім колерам.IZUMO4 мае унікальную С-канцавую вобласць, якая выглядае чорнай.Пацверджаныя і меркаваныя дысульфідныя сувязі паказаны суцэльнымі і пункцірнымі лініямі адпаведна.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) і TMEM95 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) адлюстроўваюцца ў той жа каляровай гаме, што і панэль A. Дысульфідныя сувязі паказаны пурпурным колерам.Трансмембранныя спіралі TMEM95, IZUMO2 і IZUMO3 не паказаны.
У адрозненне ад бялку IZUMO, іншыя вавёркі SPACA (напрыклад, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 і SPACA9), як мяркуюць, структурна адрозніваюцца ад SPACA6 (мал. S12).Толькі SPACA9 мае 4HB, але не чакаецца, што ён будзе мець такую ​​ж паралельна-антыпаралельную арыентацыю або такую ​​ж дысульфідную сувязь, як SPACA6.Толькі SPACA1 мае аналагічны Ig-падобны дамен.AlphaFold прадказвае, што SPACA3, SPACA4 і SPACA5 маюць зусім іншую структуру, чым SPACA6.Цікава, што SPACA4, як вядома, таксама гуляе ролю ў апладненні, але ў большай ступені, чым SPACA6, замест гэтага палягчаючы ўзаемадзеянне паміж народкам і яйкаклеткам zona pellucida52.
Наш пошук AlphaFold знайшоў яшчэ адно адпаведнасць для IZUMO1 і SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, адзіны спецыфічны для спермы трансмембранны бялок, робіць мышэй-самцоў бясплоднымі пры абляцыі 32,33.Сперматазоіды без TMEM95 мелі нармальную марфалогію, рухомасць і здольнасць пранікаць праз зону пеллюцыда і звязвацца з мембранай яйкаклеткі, але не маглі злівацца з мембранай ооцита.Папярэднія даследаванні паказалі, што TMEM95 мае структурнае падабенства з IZUMO133.Сапраўды, мадэль AlphaFold пацвердзіла, што TMEM95 з'яўляецца 4HB з той жа парай матываў CXXC, што і IZUMO1 і SPACA6, і той жа дадатковай дысульфіднай сувяззю паміж спіралямі 1 і 2, што ёсць у SPACA6 (мал. 3a і S11).Хоць у TMEM95 адсутнічае Ig-падобны дамен, ён мае вобласць з дысульфіднай сувяззю, падобную на шарнірныя вобласці SPACA6 і IZUMO1 (мал. 3b).На момант публікацыі гэтага рукапісу сервер прэпрынтаў паведаміў пра структуру TMEM95, пацвярджаючы вынік AlphaFold53.TMEM95 вельмі падобны на SPACA6 і IZUMO1 і эвалюцыйна захаваўся ўжо ў земнаводных (мал. 4 і S13).
Пошук PSI-BLAST выкарыстоўваў базы дадзеных NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP і SOF1, каб вызначыць становішча гэтых паслядоўнасцей у дрэве жыцця.Адлегласці паміж кропкамі разгалінавання паказаны не ў маштабе.
Дзіўнае агульнае структурнае падабенства паміж SPACA6 і IZUMO1 дазваляе выказаць здагадку, што яны з'яўляюцца заснавальнікамі кансерватыўнай структурнай суперсямейства, якое ўключае вавёркі TMEM95 і IZUMO 2, 3 і 4.вядомыя ўдзельнікі: IZUMO1, SPACA6 і TMEM95.Паколькі толькі некалькі членаў валодаюць Ig-падобнымі даменамі, адметнай рысай надсямейства IST з'яўляецца дамен 4HB, які мае унікальныя асаблівасці, агульныя для ўсіх гэтых бялкоў: 1) Скручаны 4HB са спіралямі, размешчанымі ў антыпаралельным/паралельным чаргаванні (мал. 5a), 2) пучок мае трохкутную грань, якая складаецца з дзвюх спіраляў унутры пучка і трэцяй вертыкальнай спіралі (мал. Ключавая вобласць (мал. 5c). Вядома, што матыў CXXC, знойдзены ў тыарэдаксінападобных бялках, функцыянуе у якасці акісляльна-аднаўленчага датчыка 54, 55, 56, у той час як матыў у членаў сямейства IST можа быць звязаны з бялковымі дысульфід-ізамеразамі, такімі як ERp57, у зліцці гамет.
Члены звышсямейства IST вызначаюцца трыма характэрнымі асаблівасцямі дамена 4HB: чатыры спіралі, якія чаргуюцца паміж паралельнай і антыпаралельнай арыентацыяй, ба-трохкутныя грані спіральных пучкоў і двайны матыў ca CXXC, утвораны паміж малымі малекуламі.) N-канчатковыя спіралі (аранжавыя) і шарнірная вобласць β-шпількі (зялёныя).
Улічваючы падабенства паміж SPACA6 і IZUMO1, была праверана здольнасць першага звязвацца з IZUMO1 або JUNO.Інтэрфераметрыя біяслою (BLI) - гэта метад звязвання, заснаваны на кінетыцы, які раней выкарыстоўваўся для колькаснай ацэнкі ўзаемадзеяння паміж IZUMO1 і JUNO.Пасля інкубацыі датчыка, пазначанага біятынам, з IZUMO1 у якасці прынады з высокай канцэнтрацыяй аналіту JUNO быў выяўлены моцны сігнал (мал. S14a), які паказвае на выкліканае звязваннем змяненне таўшчыні біяматэрыялу, прымацаванага да наканечніка датчыка.Падобныя сігналы (напрыклад, JUNO у спалучэнні з датчыкам у якасці прынады супраць аналіту IZUMO1) (мал. S14b).Ніякага сігналу не было выяўлена, калі SPACA6 выкарыстоўваўся ў якасці аналіту супраць звязанага з датчыкам IZUMO1 або прывязанага датчыка JUNO (малюнак S14a,b).Адсутнасць гэтага сігналу паказвае на тое, што пазаклеткавы дамен SPACA6 не ўзаемадзейнічае з пазаклеткавым даменам IZUMO1 або JUNO.
Паколькі аналіз BLI заснаваны на біятыніляванні свабодных рэшткаў лізіну на бялку прынады, гэтая мадыфікацыя можа прадухіліць звязванне, калі рэшткі лізіну ўдзельнічаюць ва ўзаемадзеянні.Акрамя таго, арыентацыя звязвання адносна датчыка можа ствараць стэрычныя перашкоды, таму на рэкамбінантных эктадаменах SPACA6, IZUMO1 і JUNO таксама праводзіліся звычайныя аналізы з выцягваннем.Нягледзячы на ​​​​гэта, SPACA6 не выпадае ў асадак з His-пазнакай IZUMO1 або His-пазнакай JUNO (мал. S14c,d), што сведчыць аб адсутнасці ўзаемадзеяння, якое адпавядае назіранаму ў эксперыментах BLI.У якасці станоўчага кантролю мы пацвердзілі ўзаемадзеянне JUNO з пазначаным His IZUMO1 (малюнкі S14e і S15).
Нягледзячы на ​​​​структурнае падабенства паміж SPACA6 і IZUMO1, няздольнасць SPACA6 звязваць JUNO не выклікае здзіўлення.Паверхня IZUMO1 чалавека мае больш за 20 рэшткаў, якія ўзаемадзейнічаюць з JUNO, у тым ліку рэшткі кожнай з трох абласцей (хоць большасць з іх знаходзіцца ў шарнірнай вобласці) (мал. S14f).З гэтых рэшткаў толькі адзін захоўваецца ў SPACA6 (Glu70).У той час як многія замены астаткаў захавалі свае першапачатковыя біяхімічныя ўласцівасці, асноўны астатак Arg160 у IZUMO1 быў заменены адмоўна зараджаным Asp148 у SPACA6;папярэднія даследаванні паказалі, што мутацыя Arg160Glu ў IZUMO1 амаль цалкам адмяняе звязванне з JUNO43.Акрамя таго, розніца ў арыентацыі дамена паміж IZUMO1 і SPACA6 значна павялічыла плошчу паверхні сайта звязвання JUNO эквівалентнай вобласці на SPACA6 (мал. S14g).
Нягледзячы на ​​вядомую неабходнасць SPACA6 для зліцця гамет і яго падабенства з IZUMO1, SPACA6, здаецца, не мае эквівалентнай функцыі звязвання JUNO.Такім чынам, мы імкнуліся аб'яднаць нашы структурныя дадзеныя з доказамі важнасці, прадстаўленымі эвалюцыйнай біялогіяй.Выраўноўванне паслядоўнасці гамолагаў SPACA6 паказвае захаванне агульнай структуры за межамі млекакормячых.Напрыклад, рэшткі цистеина ёсць нават у далёкіх роднасных амфібій (мал. 6а).З дапамогай сервера ConSurf даныя захавання некалькіх паслядоўнасцей з 66 паслядоўнасцей былі адлюстраваны на паверхні SPACA6.Гэты тып аналізу можа паказаць, якія рэшткі захаваліся падчас эвалюцыі бялку, і можа паказаць, якія вобласці паверхні адыгрываюць ролю ў функцыянаванні.
Выраўноўванне паслядоўнасці эктадаменаў SPACA6 з 12 розных відаў, падрыхтаванае з дапамогай CLUSTAL OMEGA.Паводле аналізу ConSurf, сінім колерам адзначаны найбольш кансерватыўныя пазіцыі.Чырвоным колерам вылучаны рэшткі цистеина.Межы даменаў і элементы другаснай структуры паказаны ў верхняй частцы выраўноўвання, дзе стрэлкі паказваюць β-ланцугі, а хвалі - спіралі.Ідэнтыфікатары доступу NCBI, якія змяшчаюць гэтыя паслядоўнасці: чалавек (Homo sapiens, NP_001303901), мандрыл (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), капуцын (Cebus mimic, XP_017359366), конь (Equus caballus, XP_023506102), касатка (Orc inus orca3_23 XP_032_034) .), авечка (Ovis aries, XP_014955560), слон (Loxodonta africana, XP_010585293), сабака (Canis lupus familyis, XP_025277208), мыш (Mus musculus, NP_001156381), тасманскі д'ябал (Sarcophilus harrisii, XP_03611, XP_0 318), Качканос, 8) , 61_89 і жаба-бык (Bufo bufo, XP_040282113).Нумарацыя заснавана на чалавечым парадку.b Прадстаўленне паверхні структуры SPACA6 з 4HB уверсе і Ig-падобным даменам унізе, колеры заснаваныя на ацэнках захавання з сервера ConSurf.Найлепш захаваныя часткі пазначаны сінім колерам, сярэдняй захаванасці — белым, найменш захаваныя — жоўтым.фіялетавы цистеин.Тры павярхоўныя патчы, якія дэманструюць высокі ўзровень абароны, паказаны на ўстаўцы, пазначанай патчамі 1, 2 і 3. Мультфільм 4HB паказаны на ўстаўцы ўверсе справа (тая ж каляровая схема).
Структура SPACA6 мае тры высока захаваныя вобласці паверхні (мал. 6b).Участак 1 ахоплівае 4HB і шарнірную вобласць і змяшчае два кансерватыўных дысульфідных маста CXXC, шарнірную сетку Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (мал. S7) і тры кансерватыўныя знешнія араматычныя рэшткі (Phe31, Tyr73, Phe137)).больш шырокі абадок Ig-падобны дамен (мал. S6e), які ўяўляе сабой некалькі станоўча зараджаных рэшткаў на паверхні спермы.Цікава, што гэты пластыр змяшчае эпітоп антыцелаў, які, як было раней паказана, перашкаджае функцыянаванню SPACA6 30.Вобласць 3 ахоплівае шарнір і адзін бок Ig-падобнага дамена;гэтая вобласць змяшчае кансерватыўныя праліны (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) і палярныя/зараджаныя рэшткі, накіраваныя вонкі.Дзіўна, але большасць рэшткаў на паверхні 4HB вельмі зменлівыя (мал. 6b), хоць зморшчына захоўваецца ва ўсім гамолагі SPACA6 (на што паказвае кансерватызм гідрафобнага ядра пучка) і за межамі надсямейства IST.
Нягледзячы на ​​тое, што гэта самая маленькая вобласць у SPACA6 з найменшай колькасцю элементаў другаснай структуры, якія можна выявіць, многія рэшткі шарнірнай вобласці (у тым ліку вобласць 3) высокакансерватыўныя сярод гамолагаў SPACA6, што можа сведчыць аб тым, што арыентацыя спіральнага пучка і β-сэндвіча гуляе ролю.як кансерватар.Аднак, нягледзячы на ​​шырокія вадародныя сувязі і электрастатычныя сеткі ў шарнірнай вобласці SPACA6 і IZUMO1, доказы ўнутранай гнуткасці можна ўбачыць у выраўноўванні некалькіх дазволеных структур IZUMO137,43,44.Выраўноўванне асобных даменаў добра перакрывалася, але арыентацыя даменаў адносна адзін аднаго вар'іравалася ад 50 ° да 70 ° ад цэнтральнай восі (мал. S16).Каб зразумець канфармацыйную дынаміку SPACA6 у растворы, былі праведзены эксперыменты SAXS (мал. S17a,b).Ab initio рэканструкцыя эктодомена SPACA6 адпавядала стрыжневай крышталічнай структуры (мал. S18), хоць графік Краткі паказаў пэўную ступень гнуткасці (мал. S17b).Гэтая канфармацыя кантрастуе з IZUMO1, у якім незвязаны бялок прымае форму бумеранга як у рашотцы, так і ў solution43.
Для канкрэтнай ідэнтыфікацыі гнуткай вобласці была праведзена маса-спектраскапія вадародна-дэйтэрыевага абмену (H-DXMS) на SPACA6 і параўнана з дадзенымі, раней атрыманымі на IZUMO143 (мал. 7a,b).SPACA6 відавочна больш гнуткі, чым IZUMO1, на што паказвае больш высокі абмен дэйтэрыем ва ўсёй структуры пасля 100 000 с абмену.У абедзвюх структурах С-канцавая частка шарнірнай вобласці дэманструе высокі ўзровень абмену, што, верагодна, дазваляе абмежаванае кручэнне 4HB і Ig-падобных даменаў адносна адзін аднаго.Цікава, што С-канцавая частка шарніра SPACA6, якая складаецца з астатку 147CDLPLDCP154, з'яўляецца высокакансерватыўным рэгіёнам 3 (мал. 6b), што, магчыма, паказвае на тое, што междоменная гнуткасць з'яўляецца эвалюцыйна захаванай асаблівасцю SPACA6.Згодна з аналізам гнуткасці, дадзеныя тэрмічнага плаўлення CD паказалі, што SPACA6 (Tm = 51,2 °C) менш стабільны, чым IZUMO1 (Tm = 62,9 °C) (мал. S1e і S19).
a H-DXMS выявы SPACA6 і b IZUMO1.Працэнт абмену дэйтэрыем вызначалі ў пазначаныя моманты часу.Узроўні вадародна-дэйтэрыевага абмену пазначаны колерам на градыентнай шкале ад сіняга (10%) да чырвонага (90%).Чорныя скрыні ўяўляюць сабой вобласці высокага абмену.Межы 4HB, шарніра і Ig-падобнага дамена, якія назіраюцца ў крышталічнай структуры, паказаны над асноўнай паслядоўнасцю.Узроўні абмену дэйтэрыем пры 10 с, 1000 с і 100 000 с былі нанесены на паласавую дыяграму, накладзеную на празрыстыя малекулярныя паверхні SPACA6 і IZUMO1.Часткі структур з узроўнем дэйтэрыевага абмену ніжэй за 50% афарбаваны ў белы колер.Вобласці, якія перавышаюць 50% абмену H-DXMS, афарбоўваюцца ў градыентную шкалу.
Выкарыстанне CRISPR/Cas9 і генетычных стратэгій выключэння гена мышы прывяло да выяўлення некалькіх фактараў, важных для звязвання і зліцця народкаў і яйкаклетак.Акрамя добра ахарактарызаванага ўзаемадзеяння IZUMO1-JUNO і структуры CD9, большасць бялкоў, звязаных са зліццём гамет, застаюцца структурна і функцыянальна загадкавымі.Біяфізічныя і структурныя характарыстыкі SPACA6 - яшчэ адна частка малекулярнай галаваломкі адгезіі/зліцця падчас апладнення.
SPACA6 і іншыя члены надсямейства IST, здаецца, вельмі кансерватыўныя ў млекакормячых, а таксама асобных птушак, рэптылій і амфібій;насамрэч, лічыцца, што SPACA6 нават неабходны для апладнення ў рыбак даніо 59. Гэта размеркаванне падобна на іншыя вядомыя бялкі, звязаныя са зліццём гамет, такія як DCST134, DCST234, FIMP31 і SOF132, што сведчыць аб тым, што гэтыя фактары дэфіцытныя па HAP2 (таксама вядомыя як GCS1) вавёркі, якія адказваюць за каталітычную актыўнасць многіх пратыстаў., расліны і членістаногія.Аплодненыя злітыя вавёркі 60, 61. Нягледзячы на ​​моцнае структурнае падабенства паміж SPACA6 і IZUMO1, накаўт генаў, якія кадуюць любы з гэтых бялкоў, прывёў да бясплоддзя ў мышэй-самцоў, што паказвае на тое, што іх функцыі ў зліцці гамет не дублююцца..У больш шырокім сэнсе ні адзін з вядомых бялкоў спермы, неабходных для фазы адгезіі зліцця, не з'яўляецца лішнім.
Застаецца адкрытым пытанне, ці ўдзельнічаюць SPACA6 (і іншыя члены суперсямейства IST) у міжгаметычных злучэннях, утвараюць унутрыгаметычныя сеткі для вярбоўкі важных бялкоў у кропкі зліцця або, магчыма, нават дзейнічаюць як няўлоўныя фузогены.Даследаванні сумеснай імунапрэцыпітацыі ў клетках HEK293T паказалі ўзаемадзеянне паміж паўнамерным IZUMO1 і SPACA632.Аднак нашы рэкамбінантныя эктадамены не ўзаемадзейнічалі in vitro, што сведчыць аб тым, што ўзаемадзеянне, назіранае ў Noda et al.абодва былі выдалены ў канструкцыі (звярніце ўвагу на цытаплазматычны хвост IZUMO1, які, як было паказана, непатрэбны для апладнення62).У якасці альтэрнатывы, IZUMO1 і/або SPACA6 могуць патрабаваць спецыфічныя асяроддзя звязвання, якія мы не прайграваем in vitro, такія як фізіялагічна спецыфічныя канфармацыі або малекулярныя комплексы, якія змяшчаюць іншыя вавёркі (вядомыя ці яшчэ не выяўленыя).Нягледзячы на ​​​​тое, што лічыцца, што эктадамен IZUMO1 забяспечвае прымацаванне народкаў да яйкаклеткі ў перывітэліннай прасторы, прызначэнне эктадамена SPACA6 незразумела.
Структура SPACA6 выяўляе некалькі кансерватыўных паверхняў, якія могуць удзельнічаць ва ўзаемадзеянні бялок-бялок.Захаваная частка шарнірнай вобласці, непасрэдна прылеглая да матыву CXXC (пазначаная ўчасткам 1 вышэй), мае некалькі звернутых вонкі араматычных рэшткаў, якія часта звязаны з гідрафобнымі і π-узаемадзеяннямі паміж біямалекуламі.Шырокія бакі Ig-падобнага дамена (вобласць 2) утвараюць станоўча зараджаную баразёнку з высокакансерватыўнымі рэшткамі Arg і His, і антыцелы супраць гэтай вобласці раней выкарыстоўваліся для блакавання зліцця гамет 30 .Антыцела распазнае лінейны эпітоп 212RIRPAQLTHRGTFS225, які мае тры з шасці астаткаў аргініна і высокакансерватыўны His220.Незразумела, ці з'яўляецца дысфункцыя з-за блакіроўкі гэтых спецыфічных рэшткаў або ўсёй вобласці.Размяшчэнне гэтага разрыву паблізу С-канца β-сэндвіча паказвае на цис-ўзаемадзеянне з суседнімі вавёркамі спермы, але не з вавёркамі ооцитов.Акрамя таго, захаванне вельмі гнуткага багатага пролінам клубка (сайт 3) у шарніры можа быць месцам бялкова-бялковага ўзаемадзеяння або, што больш верагодна, паказвае на захаванне гнуткасці паміж двума даменамі.Пол важны для невядомай ролі SPACA6.зліццё гамет.
SPACA6 валодае ўласцівасцямі міжклеткавых адгезійных бялкоў, у тым ліку Ig-падобных β-сэндвічаў.Многія адгезіўныя вавёркі (напрыклад, кадгерыны, інтэгрыны, адгезіны і IZUMO1) валодаюць адным або некалькімі β-сэндвіч-даменамі, якія распаўсюджваюць вавёркі ад клеткавай мембраны да іх навакольных мэтаў63,64,65.Ig-падобны дамен SPACA6 таксама змяшчае матыў, які звычайна сустракаецца ў β-сэндвічах адгезіі і згуртаванасці: дублеты паралельных нітак на канцах β-сэндвічаў, вядомыя як механічныя заціскі66.Лічыцца, што гэты матыў павялічвае ўстойлівасць да сіл зруху, што каштоўна для бялкоў, якія ўдзельнічаюць у міжклеткавых ўзаемадзеяннях.Аднак, нягледзячы на ​​гэта падабенства з адгезінамі, у цяперашні час няма доказаў таго, што SPACA6 ўзаемадзейнічае з яечным бялком.Эктадамен SPACA6 не здольны звязвацца з JUNO, а клеткі HEK293T, якія экспрэсуюць SPACA6, як паказана тут, практычна не ўзаемадзейнічаюць з яйкаклеткамі без зоны 32.Калі SPACA6 сапраўды ўсталёўвае міжгаметычныя сувязі, гэтыя ўзаемадзеянні могуць запатрабаваць посттрансляцыйных мадыфікацый або стабілізацыі іншымі вавёркамі спермы.У падтрымку апошняй гіпотэзы сперматазоіды з дэфіцытам IZUMO1 звязваюцца з ооцитами, дэманструючы, што іншыя малекулы, чым IZUMO1, удзельнічаюць у этапе адгезіі гамет 27.
Многія вірусныя, клеткавыя і злітыя вавёркі развіцця валодаюць уласцівасцямі, якія прадказваюць іх функцыю фузагенаў.Напрыклад, вірусныя злітыя глікапратэіны (класы I, II і III) маюць гідрафобны зліты пептыд або пятлю на канцы бялку, які ўстаўлены ў мембрану гаспадара.Карта гідрафільнасці IZUMO143 і структура (вызначаная і прадказаная) суперсямейства IST не паказалі відавочнага гідрафобнага злітага пептыда.Такім чынам, калі якія-небудзь бялкі ў надсямействе IST функцыянуюць як фузагены, яны робяць гэта спосабам, адрозным ад іншых вядомых прыкладаў.
У заключэнне можна сказаць, што функцыі членаў суперсямейства бялкоў IST, звязаных са зліццём гамет, застаюцца прывабнай загадкай.Ахарактарызаваная намі рэкамбінантная малекула SPACA6 і яе выразная структура дадуць зразумець ўзаемасувязь паміж гэтымі агульнымі структурамі і іх ролю ў прымацаванні і зліцці гамет.
Паслядоўнасць ДНК, якая адпавядае прадказанаму эктадамену SPACA6 чалавека (нумар доступу NCBI NP_001303901.1; рэшткі 27–246), была аптымізавана для экспрэсіі ў клетках Drosophila melanogaster S2 і сінтэзавана ў выглядзе фрагмента гена з паслядоўнасцю, якая кадуе Kozak (Eurofins Genomics)., сігнал сакрэцыі BiP і адпаведныя 5'-і 3'-канцы для незалежнага ад перавязкі кланавання гэтага гена ў вектар экспрэсіі pMT на аснове металлотионеинового промотора, мадыфікаванага для адбору пуромицином (pMT-puro).Вектар pMT-puro кадуе сайт расшчаплення трамбіну, за якім варта C-канцавая пазнака 10x-His (малюнак S2).
Стабільная трансфекцыя вектара SPACA6 pMT-puro ў клеткі D. melanogaster S2 (Gibco) была праведзена аналагічна пратаколу, які выкарыстоўваецца для IZUMO1 і JUNO43.Клеткі S2 размарожвалі і вырошчвалі ў асяроддзі Шнайдэра (Gibco), дапоўненай канчатковай канцэнтрацыяй 10% (аб'ём) цеплавой інактываванай фетальнай цялячай сыроваткі (Gibco) і 1X антымікатычнага антыбіётыка (Gibco).Клеткі ранняга пасажу (3,0 х 106 клетак) высаджвалі ў асобныя лункі 6-лункавых пласцін (Corning).Пасля 24 гадзін інкубацыі пры 27°C клеткі былі трансфекцыі сумессю з 2 мг вектара SPACA6 pMT-puro і рэагента для трансфекцыі Effectene (Qiagen) у адпаведнасці з пратаколам вытворцы.Трансфицированные клеткі инкубировали на працягу 72 гадзін, а затым збіралі з 6 мг/мл пуромицина.Затым клеткі вылучалі з поўнай асяроддзя Шнайдэра і змяшчалі ў бессыроватачную сераду Insect-XPRESS (Lonza) для буйнамаштабнай вытворчасці бялку.Партыю культуры клетак S2 аб'ёмам 1 л вырошчвалі да 8-10 × 106 мл-1 клетак у вентыляванай плоскадоннай поліпрапіленавай колбе Эрленмейера аб'ёмам 2 л, а затым стэрылізавалі канчатковай канцэнтрацыяй 500 мкМ CuSO4 (Millipore Sigma) і стэрыльна фільтравалі.індукаваны.Індукаваныя культуры інкубавалі пры 27°C пры 120 абаротаў у хвіліну на працягу чатырох дзён.
Кандыцыянаванае асяроддзе, якое змяшчае SPACA6, вылучалі цэнтрыфугаваннем пры 5660×g пры 4°C з наступным выкарыстаннем сістэмы фільтрацыі з тангенцыяльным патокам Centramate (Pall Corp) з мембранай MWCO 10 кДа.Вырабіце канцэнтраванае асяроддзе, якое змяшчае SPACA6, у калонку з агарознай смалой Ni-NTA (Qiagen) аб'ёмам 2 мл.Смалу Ni-NTA прамывалі 10 аб'ёмамі калонкі (CV) буфера A, а затым дадавалі 1 CV буфера A для атрымання канчатковай канцэнтрацыі імідазолу 50 мМ.SPACA6 элюировали 10 мл буфера А з даданнем имидазола да канчатковай канцэнтрацыі 500 мМ.Трамбін рэстрыкцыйнага класа (Millipore Sigma) дадаваўся непасрэдна ў дыялізную трубку (MWCO 12-14 кДа) па 1 адзінцы на мг SPACA6 супраць 1 л 10 мМ Tris-HCl, pH 7,5 і 150 мм NaCl (буфер B) для дыялізу.) пры 4°C на працягу 48 гадзін.Расшчаплены трамбінам SPACA6 затым разбаўлялі ў тры разы для памяншэння канцэнтрацыі солі і загружалі ў катыёнаабменную калонку MonoS 5/50 GL аб'ёмам 1 мл (Cytiva/GE), ураўнаважаную 10 мМ Трыс-HCl, pH 7,5.Катыёнаабменнік прамывалі 3 ОК 10 мМ Tris-HCl, pH 7,5, затым SPACA6 элюіравалі лінейным градыентам ад 0 да 500 мм NaCl у 10 мм Tris-HCl, pH 7,5 на працягу 25 ОК.Пасля іонаабменнай храматаграфіі SPACA6 канцэнтравалі да 1 мл і ізакратычна элюіравалі з калонкі ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad), ураўнаважанай буферам B. Згодна з храматаграмай, аб'ядноўвайце і канцэнтруйце фракцыі, якія змяшчаюць SPACA6.Чысціню кантралявалі афарбаваным Кумасси электрафарэзам на 16% SDS-полиакриламидном гелі.Канцэнтрацыю бялку колькасна вызначалі па абсорбцыі пры 280 нм з выкарыстаннем закона Бэра-Ламберта і тэарэтычнага малярнага каэфіцыента экстинкции.
Вычышчаны SPACA6 дыялізавалі на працягу ночы супраць 10 ммоль фасфату натрыю, pH 7,4 і 150 ммоль NaF і развялі да 0,16 мг/мл перад аналізам з дапамогай спектраскапіі CD.Спектральнае сканіраванне кампакт-дыскаў з даўжынёй хвалі ад 185 да 260 нм збіралі на спектрапалярыметры Jasco J-1500 з выкарыстаннем кварцавых кювет з даўжынёй аптычнага шляху 1 мм (Helma) пры 25 ° C са хуткасцю 50 нм / мін.Спектры CD былі скарэкціраваны па базавай лініі, асераднёны за 10 здымкаў і пераўтвораны ў сярэднюю рэшткавую эліптычнасць (θMRE) у градусах см2/дмоль:
дзе MW - малекулярная маса кожнага ўзору ў Да;N - колькасць амінакіслот;θ - эліптычнасць у міліградусах;d адпавядае даўжыні аптычнага шляху ў см;канцэнтрацыя бялку ў адз.